银柴胡不同种源抗旱性及主要药效成分比较研究

2020-06-12马玲芳叶旭波代晓华

中国野生植物资源 2020年4期

马玲芳，张亮，叶旭波，代晓华

(宁夏大学农学院，宁夏银川750021)

银柴胡为石竹科繁缕属多年生草本植物银柴胡(SterllariadichotomaL. var.LanceolateBge.)的干燥根，性微寒，味甘，有大毒，归肝、胃经。据历版中国药典记载，大约有400多年的药用历史，是制传统中成药乌鸡白凤丸的主要原料之一[1-2]。银柴胡具有清虚热、除疳热之功效，用于阴虚发热、骨蒸劳热、小儿疳热及癌症引起的虚热等症[3]；具有抗炎、治疗过敏性疾病、扩张血管等作用[4-5]。银柴胡生长区的海拔为1200～1500 m，年平均气温为7.9～8.8℃，多生长于干旱少雨的荒漠、半荒漠草原区，极耐干旱、耐贫瘠、耐寒，忌涝[6]。我国野生银柴胡主要分布在宁夏、内蒙古、陕西以及甘肃等省毗邻的干旱少雨的荒漠草原区域[7-9]。20世纪80年代后，宁夏作为中药银柴胡的道地产区，野生银柴胡人工种植引种研究首次获得成功，目前人工种植面积是全国最大产区，药材质量也得到同行业认可[9]。

近年来，随着中药材种植行业的快速发展，人工种植得以广泛推广，种子需求量越来越大，但市场上提供的种子混杂严重，种子质量参差不齐，严重影响银柴胡药材的质量与产量。目前，银柴胡真伪鉴定[10]、生理抗旱性[11]、药理成分[5, 12]、种子质量[13]、无公害栽培[14]等方面均有研究，然而就不同种源银柴胡抗旱性及主要活性成分方面的研究尚未见文献报道。因此，本研究针对宁夏中部干旱带种植区干旱雨水少，人工种植银柴胡种子混杂、种源不清、药材质量差等问题，研究分析了13份采集于不同种植区的种源材料抗旱生理指标、药材主要活性成分、产量等指标，旨在为干旱区银柴胡人工栽培提供抗旱性较强的优质种源材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验地概况

试验设在宁夏同心县王团镇旱作高效节水示范科技园区，该地处于东经105°59′，北纬36°51′，海拔1240～2625 m，年均温8.6℃，年平均降雨量273 mm，属中温带干旱、半干旱大陆性气候。

1.1.2 试验设计

试验采用单因素随机区组设计，13份种质资源材料随机排列。小区宽2.5 m，长3 m，面积为7.5 m2，行距50 cm，播深2 cm，播种密度32.98株/m2，田间管理项目水平与一般大田生产水平相同，三次重复，试验持续两年。

1.1.3 试验材料

本研究选用采自不同人工种植区的银柴胡种质资源13份(编号1～13)，于2017年秋从不同种植地采集银柴胡种子，于2018年4月28日种植于宁夏同心县王团镇旱作节水示范园区试验田。于2019年7月22日采集植株叶片进行抗旱性生理指标测定，于2019年10月13日挖取根部用于主要活性成分及产量测定。所用材料和所有植株经宁夏大学农学院李晓伟教授鉴定均为石竹科植物银柴胡(SterllariadichotomaL. var.LanceolateBge.)。其采样地和种子编号见表1。

表1 不同种源银柴胡采样地及其编号

1.2 测定方法

1.2.1 抗旱性生理指标测定

取各种源长势一致植株进行测定，将植株健康叶片装入密封袋，低温冷藏带回实验室，称取适量叶片用于生理生化指标的测定。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性采用NBT还原法[15]、过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性测定采用紫外吸收法[16]、膜透性测定采用相对电导率(Relative electric conductivity, REC)法[16]、过氧化物酶(Peroxidase, POD)活性测定采用愈创木酚法[15]、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)测定采用硫代巴比妥酸法[15]、脯氨酸(Proline, Pro)含量测定采用酸性茚三酮法[17]、可溶性蛋白(Soluble protein, SP)采用考马斯亮蓝法[16, 18]，每个指标三次重复。

1.2.2 总黄酮含量测定

参照周丽[7]的方法。精密称取真空干燥并过40目筛的药材粉末25 mg于25 mL容量瓶中，加50%乙醇25 mL至刻度，室温超声提取1.5 h，过滤作为供试品。精密吸取供试品6.0 mL于10 mL试管中，先加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，静置5 min，再加10%硝酸铝溶液0.3 mL，静置5 min，最后加1 mol·L-1氢氧化钠溶液2 mL，并用50%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置6 min，于最大吸收波长353 nm处测定吸光度值。计算方法如下：

总黄酮相对含量(mg·g-1)=(C×V×N)/M

其中，C表示标准曲线查的待测液中活性成分含量浓度(mg·mL-1)，V表示样品提取液测定体积(mL)，N表示稀释体积倍数，M表示试样质量(g)。

1.2.3 总皂苷含量测定

参照周丽[7]的方法。精确称取真空干燥并过40目筛的药材粉末0.05 g于10 mL带有刻度的具塞试管中，加甲醇至刻度，超声40 min，3500 r·min-1离心3 min，转移上清液作为供试品。精确吸取供试品2 mL于具塞试管中，水浴挥干溶剂，先加入5 %香草醛-冰乙酸0.2 mL，摇匀，再加入60%硫酸溶液5 mL，摇匀后于60℃水浴加热20 min，立即用冰水冷却，于最大吸收波长523 nm处测定吸光度值。计算方法如下：

总皂苷相对含量(mg·g-1)=(m×V1)/(M×V2)

其中，m表示标准曲线查的待测液中总皂苷含量(mg),V1表示样品提取液总体积(mL)，M表示试样质量(g),V2表示样品提取液测定用体积(mL)

1.2.4 产量测定

2019年10月13日挖取30 cm土层内的银柴胡根，用毛巾擦去根表面的土，每10根为一个重复，用米尺测定根长(cm)，用游标卡尺测定根粗(mm)，三个重复的平均值为各种源银柴胡的根长、根粗，用1/100电子天平称量根重(g)。

1.3 数据分析

采用SAS 9.4 对试验数据进行分析，Microsoft Excel 2010绘制图表，Origin 2018作图，DPS 7.05作聚类分析。

1.4 隶属函数综合评价

利用隶属函数法进行各指标隶属函数值计算，再利用各指标隶属函数值聚类分析综合评价。计算公式为：

当该指标与抗旱性呈正相关时：R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)(1)

当该指标与抗旱性呈负相关时：R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)(2)

式中：R表示各指标对应的隶属函数值；Xi表示第i个指标数据；Xmax与Xmin分别表示第i个指标中最大值与最小值。

式中：D表示抗旱性度量值；Wi为第i个指标的权重。

2 结果与分析

2.1 不同种源生理指标

2.1.1 不同种源生理指标比较

对比13个不同种源银柴胡植株叶片的各个抗旱生理指标。由图2可知，各抗旱生理指标不同种源间存在一定差异。CAT酶活性的平均值为283.29 U·(g·min)-1，最高值与最低值之间相差62.20%，差异性极显著。种源4号CAT酶活性最高，为506.15 U·(g·min)-1，与其它种源CAT酶活性差异性显著；其次是种源10号，与其他种源材料也呈显著差异。种源13号CAT酶活性最低，为191.32 U·(g·min)-1，与其他种源差异显著。种源2、3、5、7、9号之间差异不显著，种源6、8、11、12号也不显著。

SOD酶活性的平均值为234.68 U·g-1，最高值与最低值之间相差42.74%，差异性极显著。种源10号SOD酶活性最高，为308.68 U·g-1，与其它种源差异性显著；其次是种源3号，也与其他种源差异显著；种源11号的SOD酶活性最低，为176.76 U·g-1，且与其他种源差异显著；种源13、5号间差异显著，也与其它种源差异显著，种源7、2、1、12号之间差异不显著，种源1、12、8、4号之间差异不显著，种源6、9号之间差异也不显著。

POD酶活性的平均值为820.19 U·g-1，最高值与最低值之间相差31.45%，差异性极显著。种源12号的POD酶活性最高，为1031.26 U·g-1，12号与13号差异性不显著，与其它种源差异性显著；种源13号和6号POD酶活性次之，二者之间差异不显著，但与其他种源差异显著；种源1号POD酶活性最低，为706.94 U·g-1，但与种源2、4、8号之间无差异；种源5、11、7、10、9、3号之间差异不显著。

MDA含量的平均值为32.48 mol·g-1，最高值与最低值之间相差49.56%，差异性极显著。种源5号的MDA含量最高，为44.91 μmol·g-1，除和8号差异性不显著，与其它种源MDA含量差异显著；种源8号和10号的MDA含量居第二，二者之间差异不显著，与其他种源差异显著；种源3号MDA的含量最低，为22.65 μmol·g-1，除种源9号外，与其他种源差异显著；种源10、1、4号之间差异不显著，种源12、11、6、2号之间差异不显著，种源13、7、9号之间差异也不显著。

Pro含量的平均值为6.49 μg·g-1，最高值与最低值之间相差69.90%，差异性极显著。种源4号Pro含量最高，为10.05 μg·g-1，与其它种源的Pro含量差异性显著；其次是种源1号，除种源2号外，与其他种源差异显著；种源12号Pro含量最低，为3.02 μg·g-1，与其他种源差异显著；种源2、10、5、6号之间差异不显著，种源6、8、3、7号之间差异不显著，种源13、11、9号之间差异也不显著。

图1 不同种源银柴胡抗旱生理指标Fig. 1 Drought resistance physiological indexes of different provenances of S. dichotoma 注：同一图中不同小写字母代表差异性显著(P<0.001)。

可溶性蛋白含量的平均值为19.93 mg·g-1，最高值和最低值之间相差26.65%，差异性极显著。种源13号可溶性蛋白含量最低，为16.68 mg·g-1，并与其它种源差异性显著；其次是种源2号和4号；种源12号可溶性蛋白含量最高，为22.74 mg·g-1，与6号和9号无差异，与其他种源差异显著；种源2、3、4、5、8、10和、11号之间无差异。

相对电导率的平均值为51.74%，最大值与最小值之间相差35.28%，差异性极显著。种源10号相对电导率最小，为43.14%，与种源1、5、7、3、11、13号之间差异不显著；其次是种源1号，为43.28%；种源9号相对电导率最大，为66.66%，与12号无差异，与其他种源差异显著；种源6、4、2号之间差异不显著，种源8、12号之间差异也不显著。

2.1.2 不同种源抗旱性隶属函数综合评价

隶属函数综合评价值的大小反应出各种源银柴胡的抗旱性强弱，隶属函数综合评价值越高，抗旱性越强。本试验对13份不同种源银柴胡叶片内的CAT活性、POD活性、SOD活性、MDA含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、相对电导率等的测定，结合多种生理指标，利用模糊隶属函数评价法对各种源抗旱性进行综合评价。由表2可知，13份不同种源银柴胡的隶属函数综合评价值的大小即抗旱性强弱依次为：10号>4号>1号>5号>3号>2号>7号>8号>13号>6号>11号>9号>12号。再利用系统聚类法对各种源隶属函数综合评价值进行聚类，在欧距0.16处将13个种源的抗旱性分为强、中、弱3类，如图2所示，抗旱性强的种源有10、4、1、5、3、2号，抗旱性中的种源有7、8、13、6、11号，抗旱性弱的种源有9号和12号。

表2 不同种源银柴胡抗旱性综合评价结果

图2 银柴胡不同种源模糊隶属函数值的系统聚类图Fig. 2 Systematic clustering of fuzzy membership function values of different provenances of S. dichotoma

2.2 不同种源主要活性成分

由图3 可知，13个不同种源银柴胡之间总黄酮含量差异显著(P<0.01)。各种源总黄酮平均含量为5.95 mg·g-1，最高与最低相差53.01%，含量高低依次为：1号>3号>12号>2号>4号>6号>7号>5号>13号>9号>11号>8号>10号；种源1号总黄酮含量最高，为8.19 mg·g-1，与3号无显著差异，与其它种源差异性显著(P<0.01)；种源3号含量为7.45 mg·g-1，与种源1号相差1.09%；种源12号含量为7.13 mg·g-1，与种源1号相差13.01%；3号和12号之间无差异；种源10号总黄酮含量最低，为3.85 mg·g-1，但8、9、11、13号之间差异不显著，与其他种源差异显著。

图3 银柴胡不同种源总黄酮含量Fig. 3 Total flavonoids of S. dichotoma from different provenances

注：小写字母a-f代表差异性，有相同字母的表示差异性不显著(P<0.01)。

由图4可知，13个不同种源银柴胡总皂苷含量有显著差异(P<0.05)，各种源总皂苷平均含量为41.80 mg·g-1，最高与最低相差18.75%。各种源总皂苷含量高低依次为：12号>13号>2>11号>10号>3号>6号>4号>9号>5号>8号>1号>7号；12号总皂苷含量最高，为45.17 mg·g-1；其次为种源13号，为44.10 mg·g-1，与种源12号相差2.37%；第三为种源2号，为43.08 mg·g-1，与种源12号相差4.63%；种源7号总皂苷含量最低，为38.22 mg·g-1，且与5、8号之外的其他种源差异显著；其他种源之间差异不显著。

图4 银柴胡不同种源总皂苷含量Fig. 4 Total saponin content of S. dichotoma from different provenances

注：小写字母a-e代表差异性，有相同字母的表示差异性不显著(P<0.01)。

2.3 不同种源产量比较

银柴胡的根是目的收获物，人工种植的银柴胡2～3年根即可入药，根的长度和直径直接反映的是植株地下的生物量。如表3所示，不同种源银柴胡根长没有极显著性差异，平均根长为20.54 cm，8号种源材料的根长最长为23.4 cm，与种源7、13、4、5、10、6、11号没有显著差异，且分别比平均值高13.74%、10.58%、9.11%、7.33%、4.33%、3.84%、1.98%、1.57%，与其它种源有显著性差异(P<0.05)；3号种源材料的根长最短为17.3 cm，与种源1、9、2、12号没有显著差异性，且分别比平均值低15.63%、10.59%、9.03%、8.68%、8.54%；不同种源银柴胡根直径没有极显著差异，平均直径为6.49 mm，12号种源材料的根直径最大为7.56 mm，与种源7、8、13号有显著性差异(P<0.05)，13号根直径最细为5.55 mm，与7号和8号没有显著差异(P<0.05)，与12号和9号有显著性差异(P<0.05)。13份供试材料中，9号的根产量最高，为205 kg/667 m2，且除7、2、1号与其它种源材料没有显著差异(P<0.05)，而1号的根产量最低，为0.180 kg/m2，除9、5、6、12号与其它种源没有显著差异(P<0.05)。产量、根长、根直径相关性分析，产量与根直径呈显著正相关(P<0.05)，相关系数为0.63，根直径与根长呈极显著负相关(P<0.01)，相关系数为-0.68，银柴胡在干旱地区生长，主要是通过根直径大小的生长来增加产量。因此，就产量角度考虑，9、5、6、12号为高产种源材料。

表3 银柴胡不同种源产量结果

注：小写字母a-c代表差异性，有相同字母的表示差异性不显著(P<0.01)。

2.4 不同种源抗旱性、活性成分及产量相关性分析

表4为13份银柴胡抗旱性指标、活性成分及产量的相关系数。从表中可以看出，产量与总黄酮含量呈不显著负相关，与总皂苷呈不显著正相关，与抗旱性指标SOD活性呈显著负相关(P<0.05)，与相对电导率呈显著正相关(P<0.05)；总黄酮含量与总皂苷含量呈不显著负相关，与抗旱指标MDA含量、相对电导率呈不显著负相关，与POD活性无相关性，与其它抗旱指标呈不显著正相关；总皂苷含量与POD活性呈显著正相关(P<0.05)，与CAT活性、MDA含量、Pro含量、可溶性蛋白含量呈不显著负相关，与SOD含量、相对电导率呈不显著正相关；抗旱性指标POD与CAT、脯氨酸呈显著负相关(P<0.05)，CAT与脯氨酸呈极显著正相关(P<0.01)。

表4 银柴胡不同种源产量、活性成分及抗旱性指标相关系数

注：*代表显著水平P<0.05；** 代表极显著水平P<0.01

3 讨论

3.1 不同种源抗旱性研究

在干旱环境中，植物通过自身的生理生化及代谢调控途径的相互作用来抵抗外界环境。SOD是植物细胞中最重要的清除活性氧的酶之一，植物通过提高SOD酶活性来减少氧自由基对细胞造成的损害,植物抗旱性强弱可用其活性变化来反映，轻度干旱环境中SOD含量呈波动性变化[19]。CAT和POD是细胞内调节H2O2的重要的酶，将SOD酶反应产生的H2O2可被清除[19]。丙二醛含量是反应植物膜伤害的一个指标，在干旱环境中丙二醛含量会相对升高，变化大则抗旱性强[7]。游离脯氨酸是植物受到逆境胁迫时的一种重要的渗透调节物质，保护植物遭受伤害，脯氨酸积累量与植物的抗逆性呈正相关[20]。干旱环境下，植物通过可溶性蛋白渗透调节适应环境的改变，增强细胞的保水能力，对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用[21]。植物体内积累的可溶性蛋白越高，细胞的渗透势力就会越低[22]。当植物在干旱环境中时，叶片相对电导率值常作为衡量植物受害程度的指标之一，其值越小表示植物受害程度越高[23]。朗多勇[11]等研究结果表明，银柴胡生理生化特性受土壤含水量的影响，随着土壤含水量的降低，SOD和POD酶活性均逐渐降低趋势，MDA含量呈现先下降后上升的趋势，脯氨酸含量先下降后明显升高，叶片膜透性呈逐渐下降趋势，可溶性蛋白呈先增加后降低的趋势，CAT酶活性在轻度干旱条件下略微降低或升高。据此，本研究对13份银柴胡不同种源材料的7个抗旱生理生化指标根据隶属函数D值进行抗旱性强弱排序：10号>4号>1号>5号>3号>2号>7号>8号>13号>6号>11号>9号>12号。利用系统聚类法对各种源隶属函数综合评价值进行聚类，在欧距0.16处将13个种源的抗旱性分为强、中、弱3类，如图1所示，抗旱性强的种源有10、4、1、5、3、2号，抗旱性中的种源有7、8、13、6、11号，抗旱性弱的种源有9号和12号，筛选出较为抗旱的种源为种源10、4、1、5、3、2号。

3.2 不同种源活性成分研究

中药的活性成分含量是中药质量的内在标准。银柴胡的有效成分主要有黄酮类、皂苷类、甾体类、环肽类[4]等，其药用价值具有良好的发展前景，银柴胡黄酮类成分具有明显的抗菌、抗病毒作用[24-25]。徐灼辉[26]等研究发现，总黄酮含量是体现抗氧化能力的重要指标，荔枝中总黄酮含量越高其抗氧化能力越强。张子婷[27]等研究发现，广金钱草有效成分具有抗氧化，防治肾脏草酸钙结石形成、利尿、保护心脑血管抗炎等功效。赵强[28]等研究发现，鱼腥草总黄酮具有抗氧化延缓衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗过敏、抑菌性和抗疲劳作用。银柴胡皂苷类成分具有抗动脉粥样硬化作用[29]。赵英[30]等研究发现，威灵仙总皂苷具有抗肿瘤作用。章蕴毅[31]等研究发现威灵仙总皂苷具有抗炎镇痛作用。

本研究对13份银柴胡不同种源材料的，比较分析了两年生银柴胡各个种源间总黄酮、总皂苷含量的高低。两年生总黄酮含量在3.85～8.19 mg·g-1，且各种源间差异性显著，种源1、3、12、2号总黄酮含量相对较高，若以总黄酮含量作评价标准，13份不同种源银柴胡质量较好的种源有1、3、12、2号；两年生总皂苷含量在38.22～45.17 mg·g-1，且各种源间有差异性，种源12、13、2、11、10、3、6号总皂苷含量相对较高，若以总皂苷含量作评价标准，13份不同种源银柴胡质量较好的种源有12、13、2、11、10、3、6号。

3.3 不同种源相关性研究

本研究中各抗旱生理指标与产量的相关性分析结果表明，抗旱生理指标SOD活性与产量呈显著负相关，相对电导率与产量呈显著正相关，说明在干旱环境中，银柴胡各生理指标协同作用，使植株维持相对稳定的体内环境，促进了产量的增加；药材活性成分与产量无相关性；各抗旱生理指标与药材活性的相关性分析结果表明，总黄酮含量与抗旱性无相关性，总皂苷含量与抗旱生理指标POD活性呈正相关，说明银柴胡中总皂苷含量受干旱环境的影响。