Sdr9c7+/-小鼠的生长及高脂饲喂条件下血液生理生化指标分析

曾志棚，周 洁，卢伟敏，陈俏媛，贺思诺，林万华*

(1. 广西高校干细胞与医药生物技术重点实验室(广西师范大学)，广西 桂林 541006；2. 广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541006；3. 广西师范大学 校医院，广西 桂林 541006)

短链脱氢/还原酶蛋白(short-chain dehydrogenase reductase, SDR)超家族是当前发现的最大蛋白家族之一，可在所有生命体内(包括古细菌、细菌和真核生物)发现。目前人们已在人类基因组中发现了75个SDR蛋白[1]，已有若干个SDR基因被证实与阿尔茨海默症、癌症和肥胖等的发生有关[2-5]。SDR9C7基因是短链脱氢/还原酶(SDR)蛋白超家族成员之一，首先从胚胎成纤维细胞中分离克隆得到，在成年鼠和成人体内只有肝脏组织特异性高表达[6]。Takeichi等[7]发现，当SDR9C7基因纯合缺失突变时，可能会造成角质细胞中板层颗粒脂质的异常代谢和合成缺陷，导致角质层细胞间脂质缺乏，进而引起板层鱼鳞病。而Lindholm-Perry等[8]则发现在低料肉比的肉牛中，肠系膜脂肪组织中Sdr9c7等基因的表达增高，致使视黄酸的合成增多，而视黄酸的增加可能在减少这些动物的体质量和肥胖方面发挥作用。由于Sdr9c7基因对体质量和肝脏脂肪代谢的影响尚不清楚，Sdr9c7基因敲除后会导致纯合子小鼠出生后死亡(另文报道)，无法得到纯合型Sdr9c7基因敲除小鼠，因此本文使用杂合子小鼠与野生型小鼠分组对Sdr9c7+/-小鼠的生长发育、高脂饲喂条件下血液生理生化指标及肝脏石蜡组织切片进行分析。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Sdr9c7+/-小鼠由本课题组设计，委托赛业(广州)生物科技有限公司(Cyagen Biosciences Inc)运用TALEN 技术靶向Sdr9c7基因进行敲除而得。小鼠饲养在无特定病原体(specific pathogen free)级动物房，每日昼夜周期为12 h，室内温度保持(25±2) ℃，自由采食和饮水。

1.2 材料与试剂

鼠尾裂解液(100 mmol/L Tris-Cl、5 mmol/L EDTA、200 mmol/L NaCl、20 g/L SDS)，2×Taq PCR Master Mix(购自Tiangen公司)，波氏固定液、二甲苯、苏木素和伊红染色液(购自索莱宝公司)。普通饲料购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。高脂饲料购自上海华雅思创生物科技有限公司(Research Diets，货号D12492(灭菌))，其热量构成比为碳水化合物20%、脂肪60%、蛋白质20%，总热量为5.24 kcal/g。葡萄糖(GLU)、血清总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、低密度胆固醇(LDL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶 (AST)、尿素(BUN)、肌酐 (CREA)等测定试剂购自上海复星长征医学科学有限公司。

1.3 小鼠基因型鉴定

小鼠出生1周后，对其进行编号并采集鼠尾组织提取DNA，PCR扩增DNA，1%凝胶电泳检测扩增产物条带大小无误后，将PCR产物交由天一辉远基因科技有限公司测序，根据测序结果确定小鼠的基因型。

1.4 普通饲料和高脂饲料饲喂条件下小鼠生长曲线绘制

以分别来自8窝的同周龄杂合子型(Sdr9c7+/-) 和野生型(Sdr9c7+/+)8对雄性小鼠作为实验用鼠，分为mSdr9c7+/+组和mSdr9c7+/-组，普通饲料饲喂，每周称体质量至16周龄，绘制生长曲线。同样方法取8对雄性小鼠，5周龄时开始饲喂高脂饲料，每周称体质量至28周龄，绘制生长曲线。

1.5 高脂饲喂小鼠血清采集及各项生化指标测定

高脂饲料喂养至15和28周龄时，鼠尾采血法收集0.2～0.3 mL血液至1.5 mL离心管中，室温静置30 min，血液凝固析出血清，2 000 r/min离心10 min后分离出血清，用全自动生化分析仪(迪瑞 CS-600B)检测小鼠的GLU、TCHO、TG、LDL、ALT、AST、BUN、CREA等生理生化指标。

1.6 高脂饲喂小鼠肝脏系数测定和组织石蜡切片

高脂喂食28周龄时，眼球放血法处死小鼠，将完整肝脏取出，PBS液清洗后用纸巾吸去多余PBS并称量，计算肝脏系数： 肝脏系数=肝脏质量/体质量。

1.7 小鼠组织石蜡切片制备与观察

将肝脏组织剪成厚度0.3～0.5 cm，长宽不超过1 cm的小块，用波氏固定液固定24 h。取已固定好的肝脏组织流水冲洗12 h，通过系列梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(10 μm厚)、二甲苯和系列梯度酒精脱蜡复水，苏木精-伊红染色法染色，中性树脂封片，在普通光学显微镜下观察小鼠肝脏组织石蜡切片并拍照保存，用Image J软件分析40倍组织切片图像中肝细胞脂质空泡面积占总面积的百分比。

2 结果

2.1 小鼠基因型鉴定

野生型测序图谱中小鼠含有完整 (AGCTGCAGACC) 片段，杂合子小鼠的测序图谱中(AGCTGCAGACC) 片段缺失，且其后出现2个峰的叠加，如图1所示。

图1 小鼠基因型测序图谱Fig. 1 Genotype sequencing map of mouse

2.2 小鼠生长曲线

普通饲料喂养或高脂饲料喂养条件下，与野生型小鼠(mSdr9c7+/+)相比，杂合子小鼠(mSdr9c7+/-)正常生长发育与繁殖，二者的体质量生长曲线无显著差异，详见图2和图3。

图2 普通饲料喂养条件下野生型小鼠(mSdr9c7+/+)与杂合子小鼠(mSdr9c7+/-)的生长曲线Fig. 2 Growth curve of wild type mice (mSdr9c7+/+) and heterozygous mice (mSdr9c7+/-) fed with regular chow

图3 高脂饲料喂养条件下野生型小鼠(mSdr9c7+/+)与杂合子小鼠(mSdr9c7+/-)的生长曲线Fig. 3 Growth curve of wild type mice (mSdr9c7+/+) and heterozygous mice (mSdr9c7+/-) fed with high-fat diet

2.3 肝脏系数

高脂饲料喂养24周后，杂合子小鼠(mSdr9c7+/-)的肝脏系数(0.045 0±0.002 9)与野生型小鼠(mSdr9c7+/+)的肝脏系数(0.042 0±0.002 6)相比，二者并无显著差异(P>0.05)，如图4所示。

图4 高脂饲料喂食24周后小鼠肝脏系数Fig. 4 Liver coefficient of mice after 24 weeks of high-fat diet

2.4 小鼠肝脏组织石蜡切片

高脂饲料喂食24周后，两组小鼠的肝脏均发生明显的脂肪变性，光学显微镜下观察到肝细胞脂质空泡明显形成，但两组间空泡面积并无显著差异(mSdr9c7+/+占比为(54.20±1.062)%，mSdr9c7+/-占比为(55.68±0.931)%)，如图5所示。

图5 高脂饲料喂食24周后野生型小鼠(mSdr9c7+/+)与杂合子小鼠(mSdr9c7+/-)的肝脏组织石蜡切片Fig. 5 Paraffin sections of liver tissue of wild type mice(mSdr9c7+/+) andheterozygous mice (mSdr9c7+/-) after 24-week high-fat diet

2.5 血液生理生化指标

当小鼠高脂饲料喂食11周后，与mSdr9c7+/+组相比，mSdr9c7+/-组的各项血液生理生化指标无显著差异(P>0.05)；而当喂食24周后，与mSdr9c7+/+组相比，mSdr9c7+/-组的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶 (AST)的酶活性显著增高(P<0.05)，但葡萄糖(GLU)、血清总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、低密度胆固醇(LDL)、尿素(BUN)、肌酐 (CREA)等指标无显著差异(P>0.05)，如表1所示。

表1 高脂饲料喂食后小鼠的各项血液生理生化指标

注：与mSdr9c7+/+相比，*表示P<0.05。

3 讨论

本文实验发现Sdr9c7+/-杂合子小鼠的生长发育未受到明显影响，与野生型小鼠相比生长曲线无显著差异。高脂饲料喂食小鼠制备肥胖动物模型是目前研究肥胖、高脂血症及肝脏非酒精性脂肪性肝病的通用手段，血液生理生化指标对脂肪肝的诊断和鉴别有重要的参考意义[9-10]。本文通过测定高脂饲料喂食后小鼠的各项血液生理生化指标，发现用于检测血糖血脂的生理指标(包括GLU、TCHO、TG、LDL等)在杂合子小鼠和野生型小鼠两组间并无显著性差异，两组间肝脏系数亦无明显差异，肝脏组织的石蜡切片结果也显示两组小鼠的肝脏组织结构无明显差异，由此推测Sdr9c7基因没有参与调控肝脏的脂肪沉积。此外，本文还检测了BUN和CREA的生理指标，结果显示两组间并无显著性差异。但在高脂喂食24周后，杂合子小鼠血清中AST和ALT的含量较野生型小鼠的含量显著增加(P<0.05)。AST和ALT是检测肝功能的主要指标，当发生肝损伤时，其含量上调，而在成年鼠和成人体内SDR9C7基因的表达呈肝脏组织特异性高表达[6]，因此推测Sdr9c7可能与肝脏的炎症发生有一定的联系。相关报道表明SDR9C7基因的表达与皮炎相关[7，11-12]。Sdr9c7+/-杂合子小鼠在高脂饲料饲喂条件下发生更严重的肝炎的机制有待进一步研究。