miR-223-3P对肺鳞癌细胞顺铂敏感性的影响

冯坤丽，罗 朋，王保龙

在中国，非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)大约占肺癌病例的85%[1]，是肺癌的主要形式，经各种临床手段治疗的肺鳞癌患者的5年生存率仍然很低，其中肺鳞癌主要以顺铂(cisplatin、CDDP)化疗为主，容易产生耐药性[2]。miRNAs已知可以调控多种基因的表达，进而影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[3]。研究[4]显示，miRNA既可以作为癌基因，也可以作为抑癌基因，并且在大多数恶性肿瘤中都表达异常。前期通过构建肺鳞癌患者来源的移植瘤(patient derived tumor xenograft, PDTX)模型筛选出在肺鳞癌组织中下调的miR-223-3p[5]，为鉴定miR-223-3p在肺鳞癌CDDP耐药中的调控作用，采用瞬时转染分别上调和下调miR-223-3p的表达，研究miR-223-3p影响肺鳞癌CDDP耐药性的分子机制，以期探究肺鳞癌诊断和治疗的新型标志物。

1 材料与方法

1.1 材料肺鳞癌SK-MES-1和NCI-H520细胞株(上海生命科学研究院)；DMEM高糖培养基(加拿大，Wisent)；RPMI 1640培养基(北京全式金生物，Transgen Biotech)；胎牛血清(澳洲，Gibco)；非编码RNA引物、miR-223-3p inhibitor、mimics及其阴性对照(NC)组(合肥通用生物、上海吉玛公司合成)；qRT-PCR检测试剂盒(南京诺唯赞、日本Takara公司)；CCK-8检测试剂盒(日本同仁公司)；CDDP(上海Sigma公司)；细胞凋亡检测(南京诺唯赞公司)；细胞总蛋白提取试剂(南京贝博公司)；ZEB1、E-Cadherin和Bax抗体(武汉Proteintech公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 在37 ℃、5% CO2的培养环境下，用DMEM高糖培养基培养SK-MES-1细胞，RPMI 1640培养基培养NCI-H520细胞。待培养皿内细胞密度达90%时进行传代，通常按照1 ∶3或1 ∶2进行细胞传代。

1.2.2细胞瞬时转染 按照Lipofectamine 2000转染试剂说明进行实验步骤，将miR-223-3p mimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor分别转染于SK-MES-1和NCI-H520 细胞中。

1.2.3qRT-PCR检测miR-223-3p表达 细胞作相应处理后，利用TRIzol 提取各组细胞RNA，运用Takara 逆转录和qRT-PCR 试剂盒检测miR-223-3p表达，以U48作为内参，以2-ΔΔCT计算miR-223-3p相对表达量。

1.2.4CCK-8法检测细胞对CDDP药物敏感性变化 将miR-223-3p mimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor转染SK-MES-1和NCI-H520细胞，分别于转染24 h细胞贴壁后更换培养基，分别向培养基加入 0、1、2、4、8、16、32 μmol/L的7个不同浓度梯度CDDP，平行设置5个复孔。自动酶标仪测定双波长450 630nm处的吸光度(A)值，最终由Graphpad软件计算出细胞半数抑制浓度(half inhibition concentration，IC50)。

1.2.5细胞凋亡检测 miR-223-3p mimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor分别转染SK-MES-1和NCI-H520 细胞，转染24 h后，分别在培养基中加入终浓度为80 μmol/L的CDDP，12 h后收集细胞，采用Annexin V FITC/PI双染法，计算细胞凋亡率，细胞凋亡率=(早期细胞凋亡数 + 晚期细胞凋亡数)/ 总细胞数×100%。

1.2.6肺鳞癌SK-MES-1细胞株(具有迁移能力)的Transwell迁移实验 待测细胞培养至融合度达90%左右，0.25%胰酶消化液消化细胞，用无血清培养基重悬细胞并将细胞浓度调整为2×105/ml。在24孔板底部和上部分别加入600 μl含10%血清的培养基和100 μl细胞悬液，继续在温箱孵育，每隔一段时间镜下观察，如24、48、72 h，用直尺测量细胞愈合度。

1.2.7Western blot检测转染后SK-MES-1细胞BCL2同源的水溶性相关蛋白(Bax)、E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达变化 将miR-223-3p mimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor转染SK-MES-1细胞，作用72 h后提取总蛋白，离心收集蛋白上清液，BCA 法进行浓度测定，蛋白煮沸变性后可放-80 ℃保存。以25 μg的蛋白量上样并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚偏二氟乙烯膜上电转90 min后室温封闭2 h，再分别加入ZEB1(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶6 000)抗体，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜4 次，每次8 min。加入羊抗兔/羊抗鼠二抗(武汉Proteintech公司，1 ∶6 000稀释)，以β-actin作为内参，分析蛋白表达水平。

1.3 统计学处理以上实验均重复至少3次以上，所得数据用表示，2个独立样本之间均值的比较，采用的统计推断方法为t检验，样本统计量t值大小用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因干扰与过表达效率验证通过qRT-PCR定量检测miR-223-3p的表达量，差异有统计学意义(miR-223-3p mimics组t=-31.00，P<0.05；miR-223-3p inhibitor组t=15.000，P<0.05)。见图1。

A：NC-mimics； B：miR-223-3p mimics； C：NC-inhibitor； D：miR-223-3p inhibitor； 与NC-mimics比较：**P<0.05；与NC-inhibitor比较：##P<0.05

2.2 升高miR-223-3p表达增加SK-MES-1和NCI-H520肺鳞癌细胞的CDDP敏感性将miR-223-3p mimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor转染SK-MES-1和NCI-H520细胞株，分别升高和降低细胞内miR-223-3p的表达水平，结果显示升高细胞内miR-223-3p的表达可以增加肺鳞癌细胞对CDDP药物的敏感性，差异有统计学意义(SK-MES-1 miR-223-3p mimics组t=99.000，P<0.01；miR-223-3p inhibitor组t=-111.000，P<0.01；NCI-H520 miR-223-3p mimics组t=50.000，P<0.05；miR-223-3p inhibitor组t=-33.000，P<0.05)。见表1、图2。

表1 肺鳞癌细胞对不同浓度CDDP敏感性的影响

2.3 干扰miR-223-3p后CDDP诱导肺鳞癌细胞凋亡率减少将miR-223-3p mimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor分别转染SK-MES-1和NCI-H520细胞株，在相同剂量CDDP药物(80 μmol/L)的诱导下，作用12 h，流式细胞术检测细胞凋亡，miR-223-3p mimics+CDDP组细胞凋亡增加，而miR-223-3p inhibitor+CDDP组细胞凋亡减少。见图3。

2.4 下调肺鳞癌SK-MES-1细胞中miR-223-3p表达，细胞的迁移能力增加分别将miR-223-3p mimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor转染SK-MES-1细胞后，Transwell实验结果显示，miR-223-3p mimics组和NC mimics组比较，镜下可见细胞迁移能力减弱，细胞愈合宽度miR-223-3p mimics组高于NC mimics组；同样，miR-223-3p inhibitor组和NC inhibitor组相比较，细胞迁移能力增强，细胞愈合宽度miR-223-3p inhibitor组低于NC inhibitor组，结果表明下调miR-223-3p的表达可以增强肺鳞癌细胞的迁移能力。见图4。差异有统计学意义(miR-223-3p mimicst=-13.000，P<0.05；miR-223-3p inhibitort=29.000，P<0.05)。

图2 不同细胞株转染后细胞生存率的比较

图3 不同细胞株转染后分别加入相同剂量的CDDP，流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化

A：SK-MES-1；B：NCI-H520；a：NC-mimics； b：miR-223-3p mimics；c：NC-inhibitor；d：miR-223-3p inhibitor；与NC-mimics比较：***P<0.01；与NC-inhibitor比较：▼▼P<0.05

2.5 肺鳞癌SK-MES-1细胞株过表达miR-223-3p促进上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)Western blot结果显示，miR-223-3p mimics组相对于NC-mimics组，表现为抑癌作用，ZEB1蛋白表达量降低(t=18.333，P<0.05)，E-cadherin和Bax蛋白表达量增加(t=-39.000，P<0.05；t=-29.000，P<0.05)；而miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor组相比较，表现为促进肿瘤细胞增殖迁移，ZEB1蛋白表达量增加(t=-99.000，P<0.01)，E-cadherin和Bax蛋白表达量减少(t=21.500，P<0.05；t=69.000，P<0.01)。见图5。说明下调miR-223-3p的表达可以促进肺鳞癌细胞的迁移能力，可能通过促进上皮间质转化，进而诱导肺鳞癌细胞耐药的产生。

3 讨论

肺癌是世界病死癌症中最常见的癌症之一[6]。 随着我国工业化发展造成的环境污染加重，肺癌患病率不断上升。肺癌中约85%为NSCLC，目前肺鳞癌最主要的治疗手段包括使用铂类药物进行化疗，然而肺鳞癌天然耐药，具体的耐药机制尚不清楚[7]。近年来，大量文献[8-10]报道，化疗药物CDDP、卡铂等耐药都与EMT息息相关，EMT可促进肿瘤细胞的侵袭以及转移，目前已经成为肿瘤侵袭转移以及癌症耐药相关分子机制研究领域的热点[11]。在EMT过程中，最主要的生物标记分子E-cadherin表达会减少，另外还涉及其他分子标记物的表达变化，如波形蛋白、神经钙粘素、β-联蛋白及ZEB1蛋白等[11]。通过EMT，上皮细胞失去了与基底膜的连接，从而获得了更高的侵袭迁移能力[12]。随着不断兴起的新型检测技术，包括高通量测序、miRNA基因芯片检测等，研究[13]发现miRNAs的差异表达水平会直接或间接的影响肿瘤分子耐药。在慢粒急变细胞系中发现阿霉素耐药株比其亲本细胞株抑制肿瘤细胞增长需要更高的阿霉素浓度，通过基因芯片技术检测两者的miRNA 差异表达水平发现耐药株与亲本株相比，其中的miR-221表达上调，而let-7f、miR-424则显著下调，提示这些差异表达的miRNA可能影响白血病治疗中的阿霉素耐药机制研究。也有研究[14]报道食道鳞状上皮细胞癌中miR-27a显著下调，耐药株与亲本株相比PgP蛋白表达也下调，从而说明食道癌中差异表达的miR-27a通过影响PgP蛋白的表达来促进肿瘤耐药。Pan et al[15]发现乳腺癌细胞中差异表达的miR-328通过作用于靶蛋白ABCG2的3′-UTRs，抑制ABGG2的表达来提高肿瘤细胞的化疗敏感性。但是，目前相关的miRNAs的分子研究还未成熟，依然在探索阶段，亟需进一步了解miRNAs的功能为临床诊治肺鳞癌患者提供更有效的信息。

图4 SK-MES-1细胞转染72 h后细胞
愈合宽度的变化×40

与NC-mimics比较：★★P<0.05；与NC-inhibitor比较：▲▲P<0.05

图5 Western blot法检测SK-MES-1细胞中ZEB1、BAX和E-cadherin蛋白的表达

A：NC-mimics；b：miR-223-3p mimics；c：NC-inhibitor；d：miR-223-3p inhibitor；与NC-inhibitor比较：**P<0.01；与NC-mimics比较：▼▼P<0.01

为了研究miR-223-3p对肺鳞癌细胞CDDP敏感性的影响，课题前期通过构建PDTX模型，基因芯片分析成瘤组和未成瘤组的肿瘤组织，筛选出差异明显、争议较大且对肿瘤的发生发展有重要影响的miR-223-3p。为进一步探究miR-223-3p在肺鳞癌细胞CDDP耐药中的作用，通过分别升高或降低肺鳞癌NCI-H520和SK-MES-1细胞内miR-223-3p的含量后，CCK-8实验证实了升高细胞内miR-223-3p的表达可以增加肺鳞癌细胞对CDDP药物的敏感性。在相同剂量CDDP药物的诱导下，流式细胞术结果表明这种耐药性与化疗药物诱导的凋亡相关，上调miR-223-3p的表达可以导致肺鳞癌细胞凋亡比率增加。此外，Western blot结果显示EMT相关蛋白ZEB1表达下降，E-cadherin表达显著增高，表明miR-223-3p可能通过诱导EMT形成，进而影响肺鳞癌细胞CDDP耐药性。然而，具体的分子机制尚有待进一步深入探索研究。

综上所述，通过构建PDTX模型、基因芯片技术，在肺鳞癌成瘤与未成瘤组织中筛选出肺鳞癌CDDP耐药相关的差异表达的miR-223-3p，为下一步研究其在肺鳞癌耐药中的机制奠定了基础。肺鳞癌组织中低表达miR-223-3p通过诱导EMT形成进而促进CDDP耐药性，其有望成为肺鳞癌靶向治疗的新的分子标志物。