黄精覆盆子发酵饮品化学成分的UPLC-HRMS分析△

梅晓丹，李洁，王喻淇，宋帅，乔延江，林峰,*，张加余

1.滨州医学院 药学院，山东 烟台 264003；2.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；3.江苏菌钥生命科技发展有限公司，江苏 盐城 224100

中药发酵炮制技术在我国已有数千年的历史。张仲景的《金匮要略》、贾思勰的《齐民要术》以及李时珍的《本草纲目》等著名中药典籍中都有关于中药发酵炮制的记载和解释[1-2]。该技术在适当的温度和湿度下，借助生物转化作用对中药进行发酵，从而达到减毒增效、扩大药用范围的目的[3-4]。随着科技的进步与发展，中药发酵炮制技术在中药研究领域应用更加广泛，具有广阔的发展前景。

黄精覆盆子发酵饮品是1种由黄精和覆盆子等中药发酵制得的饮品。黄精和覆盆子均为我国常用中药，具有益肾功效，亦可用于食疗和保健。研究表明，黄精的主要化学成分为多糖、甾体皂苷、黄酮、蒽醌、木脂素以及生物碱等成分，具有抗衰老、抗肿瘤、抗菌、调节血糖和调节免疫等作用[5-6]；覆盆子中主要含有黄酮、萜类、甾醇以及挥发油等成分，用于治疗遗尿尿频、遗精滑精及目暗昏花等[7-8]。本研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱法(UPLC-HRMS)技术对黄精覆盆子饮品发酵前后的化学成分进行分析，以明确发酵前后其活性成分种类的变化，为其药用价值的进一步开发利用奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

LTQ-Orbitrap XL质谱仪[美国Thermo Fisher公司，配有电喷雾离子源(ESI)和 Xcalibur 2.1工作站]；DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)；R200D型电子分析天平(十万分之一，德国Sartorius公司)；Milli-Q Synthesis超纯水纯化系统(美国Millipore公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Grace PureTMSPE C18-Low固相萃取小柱[500 mg·(3 mL-1),Sigma公司]。

1.2 试药

对照品腺苷、芦丁、山柰酚、菝葜皂苷元和薯蓣皂苷元(成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98%)；质谱级甲醇、乙腈(美国Thermo Fisher公司)；色谱级甲酸(德国Merck公司)；超纯水。

黄精、覆盆子和山药药材均购自亳州市华云中药饮片有限公司，均由北京中医药大学张媛副教授鉴定。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1混合对照品溶液的制备 分别取腺苷、芦丁、山柰酚、菝葜皂苷元和薯蓣皂苷元5种对照品适量，精密称定，加入甲醇配制成质量浓度约为100 μg·mL-1的储备液，用时稀释成浓度适宜的混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备 黄精覆盆子未发酵供试品溶液的制备：分别取黄精、覆盆子和山药粉末各10 g，精密称定，加入300 mL纯净水，搅拌均匀后，加入适量的 NaHCO3和K2HPO4等调节pH为5.8～6.0，再加入20 g蛋白胨和80 g白砂糖，定容至1000 mL。溶液在90 ℃水浴条件下灭菌30 min。

黄精覆盆子发酵供试品溶液的制备：分别取黄精、覆盆子和山药粉末各10 g，精密称定，加入300 mL纯净水，搅拌均匀后，加入K2HPO4调节pH 为4.5～5.0；然后在混合液中添加1 g纤维素酶和1 g果胶酶，于50 ℃下酶解90 min；再加适量的 NaHCO3和K2HPO4等调节pH为5.8～6.0，然后加入20 g蛋白胨和80 g白砂糖，定容至1000 mL。溶液在90 ℃水浴条件下灭菌30 min，待温度降至室温，接种肠膜明串株菌肠膜亚种发酵(培养温度为25 ℃，发酵20 d)。

供试品溶液的处理：取固相萃取小柱，先用5 mL甲醇活化，再用5 mL去离子水平衡。然后分别加入上述供试品溶液各2 mL，依次用5 mL水和5 mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，于室温条件下用N2吹干，残渣加入200 μL 2%乙腈溶液复溶，涡旋振荡3 min，14 000 r·min-1(离心半径为9.38 cm)离心15 min，吸取上清液，即得。

2.2 分析条件

2.2.1色谱条件 色谱柱：Waters HSS T3 UPLC色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～2 min，2%B；2～5 min，2%～5%B；5～35 min，5%～25%B；35～45 min，25%～40%B；45～46 min，40%～90%B)；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；进样量：2 μL。

2.2.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；毛细管温度：350 ℃；管透镜电压：-110 V；毛细管电压：-35 V；喷雾电压：3 kV；辅助气流速：3 L·min-1；鞘气流速：9 L·min-1；傅里叶高分辨扫描范围m/z50～1500；一级扫描分辨率：30 000；二级质谱采用数据依赖性扫描方式进行数据获取；激活时间：30 ms；激活能量单位：0.25 q；归一化碰撞能量：35%。

2.3 质谱数据的预处理

利用Xcalibur 2.1工作站处理数据，通过分子式预测模块预测母离子和子离子的分子式，相关参数设定为C[0～50]、H[0～100]、O[0～20]、N[0～5]、环不饱和双键数[0～15]，质量精度误差在1×10-5以内。

3 结果与讨论

本研究采用UPLC-HRMS技术对发酵前后黄精覆盆子饮品中的化学成分变化情况进行研究。结合对照品比对、文献报道以及液质提供的精确分子量与多级质谱碎片离子信息，共分析鉴定了60个化学成分(发酵前49个，发酵后22个)。其中，甾体皂苷类成分有42个，三萜类成分有3个，黄酮类成分有9个，生物碱类成分有6个，结果见图1、表1。

注：A.发酵前；B.发酵后。图1 黄精覆盆子发酵饮品的提取离子流图

表1 发酵前后黄精覆盆子饮品中化学成分的质谱信息

分子式[M+H]+鉴定结果裂解碎片及丰度裂解碎片及方式理论值(m/z)实际值(m/z)误差(×10-6)峰号tR发酵前发酵后来源C10H14O4N5腺苷MS2[268]:136(100),268(10),250(1)MS2[268]:136(M+H-D-Rib),250(M+H-H2O)268.104 03268.103 58-1.681∗3.43++黄精/山药C9H12O2Npolygonatine A or isomerMS2[166]:120(100),166(5),148(3)MS2[166]:120(M+H-CO-H2O),148(M+H-H2O)166.086 25166.086 20166.085 94166.086 09166.085 89166.085 80-0.33-1.89-0.99-2.19-2.742348124.9911.9012.1717.0422.66-++--++-++黄精黄精黄精黄精黄精C39H61O13kingianoside B or isomerMS2[737]:575(100),557(7),397(5)MS2[737]:575(M+H-Glc),557(M+H-H2O-Glc),397(M+H-O-Glc-Gal)737.410 66737.415 16737.417 54737.408 63737.408 334.093.31-2.76-3.17511405013.8420.8335.7038.00--++++--黄精黄精黄精黄精C32H51O9huangjinoside C or isomerMS2[579]:561(100),419(39),269(38)MS2[579]:561(M+H-H2O),419(M+H-CO-Ara)579.352 76579.347 78579.348 69579.351 32579.350 59-4.59-3.02-2.48-3.7467515215.2316.0238.2438.81--+++--+黄精黄精黄精黄精C39H63O17huangjinoside LMS2[803]:478(100),785(38),461(2)MS2[803]:478(M+H-Glc-Gal),785(M+H-H2O),460(M+H-H2O-Glc-Gal)803.405 97803.401 73-2.28917.54-+黄精C15H13O6aromadendrinMS2[289]:271(100),243(14),216(6),272(5)MS2[289]:271(M+H-H2O),243(M+H-H2O-CO)289.070 66289.070 34-1.121018.43+-覆盆子C21H25O10phlorizinMS2[437]:293(100),185(3),275(3)MS2[437]:275(M+H-Glc)437.144 22437.140 81-3.801325.01+-覆盆子C27H31O16芦丁MS2[611]:303(100),465(37),449(4)MS2[611]:303(M+H-Rha-Glc),465(M+H-Rha),449(M+H-Glc)611.160 66611.159 30-2.2214∗25.46+-黄精/覆盆子

续表1

注：*与对照品比对鉴定；+为检测到；-为未检测到；Glc为葡萄糖基；Rha为鼠李糖基；Gal为半乳糖基；Ara为阿拉伯糖基；Fuc为岩藻糖基；D-RibD为核糖基；EF为甾体皂苷的E、F环。

3.1 甾体皂苷类成分的分析鉴定

甾体皂苷类化合物是黄精的主要药效成分和特征性成分，具有调节血糖、调节免疫、抗肿瘤、抗抑郁、改善学习记忆等作用[9]。该类成分的母核主要有菝葜皂苷元、薯蓣皂苷元及毛地黄糖苷元等[10]。其中，薯蓣皂苷元为甾体皂苷元骨架的一级氧化水平，是高氧化甾体皂苷元生物合成的前体化合物。在多个级别的氧化水平上，借助不同位置的氧化反应，若干多氧取代化合物的产生构成了黄精属甾体皂苷元的分子多样性[11]。此外，糖基部分的结构也是形成黄精属植物甾体皂苷分子多样性的关键因素，其连接糖基的主要有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖及岩藻糖等。本实验共鉴定了42个甾体皂苷类成分，以下选择代表性的甾体皂苷元和皂苷为例进行结构解析过程的阐释。

在正离子模式下，M59的准分子离子峰[M+H]+为m/z417.335 45，推测其分子式为C27H45O3，误差为-2.08×10-6。在其 ESI-MS2图谱中，产生了碎片离子m/z399和m/z271。推测m/z399是由m/z417脱去1分子H2O产生的，m/z271由m/z417丢失EF环和1分子CH3形成。通过与对照品的多级质谱裂解行为与保留时间进行比对，可将M59准确鉴定为菝葜皂苷元。

M60的准分子离子峰[M+H]+为m/z415.319 70，可知其分子式为C27H43O3(误差-2.34×10-6)。在其二级质谱图中，产生了m/z397[M+H-H2O]+、271[M+H-EF环]+和253[M+H-EF环-H2O]+等碎片离子。结合对照品比对和相关文献[12]，可将M60准确鉴定为薯蓣皂苷元。

M31的色谱保留时间为32.99 min，其准分子离子峰[M+H]+为m/z915.457 76，推测其分子式为C45H71O19，误差为-0.70×10-6。在多级质谱裂解过程中，m/z915通过丢失1分子H2O产生碎片离子。而另一个碎片离子m/z431[M+H-2Glc-Gal]+的产生表明结构中存在2个葡萄糖基团和1个半乳糖基团。推断M31可能为pratioside D1。

m/z869.451 54为M34正离子模式的准分子离子峰[M+H]+，分子式为C44H69O17(误差-1.59×10-6。在其 ESI-MS2图谱中，m/z869产生了碎片离子707[M+H-Glc]+和571[M+H-Glc-EF环]+，表明其分子结构中存在葡萄糖基团。由此可将M34鉴定为kingianoside K。

3.2 三萜类成分的分析鉴定

覆盆子中含有较为广泛的萜类成分，二萜类和三萜类是其特征性成分，其中尤以三萜类成分居多。三萜类化合物的母核主要为熊果酸型和齐墩果烷型，以熊果酸型居多，此类化合物多以结合态存在，成苷后糖大多连在28位[13]。本实验共鉴定了3个三萜类成分，发酵前有3个，发酵后有1个。

M56的色谱保留时间为43.94 min，其准分子离子峰[M+H]+为m/z489.355 93。根据由高分辨质谱所获得的精确分子量推测其最可能的分子式为C30H49O5，误差为-3.10×10-6。在二级质谱图中，[M+H]+离子产生了m/z471[M+H-H2O]+、453[M+H-2H2O]+、435[M+H-3H2O]+、417[M+H-4H2O]+和 373[M+H-2H2O-CO2]+等一系列碎片离子。这些离子的产生证明该分子结构中存在羧基和多个羟基。由此可将M56鉴定为阿江榄仁酸(arjunic acid)。

在正离子模式下，M57的准分子离子峰[M+H]+为m/z473.363 71，推断其最可能的分子式为C30H49O4，误差为2.47×10-6。在质谱裂解过程中，m/z473脱去1分子CO2产生二级碎片离子m/z429，m/z429进一步丢失1分子H2O生成m/z411。以上裂解过程表明该分子结构中含有羧基和羟基。因此，M57被鉴定为山楂酸(maslinic acid)。

M58在正离子模式下的准分子离子峰[M+H]+为m/z503.334 96，其可能的分子式为C30H47O6(误差-3.48×10-6)。m/z503分别脱去1分子H2O、2分子H2O和3分子H2O产生ESI-MS2碎片离子m/z485、m/z467和m/z449，m/z485进一步裂解，脱去1分子CO生成m/z457。以上质谱裂解过程表明，该分子结构中存在羧基和多个羟基。由此可将M58鉴定为2α，19α，24-三羟基熊果-12-烯-3-酮基-28-酸(2α，19α，24-trihydroxyurs-12-ene-3-oxo-28-acid)。

3.3 黄酮类成分的分析鉴定

黄精和覆盆子中均含有黄酮类成分，其存在形式既有游离型的，也有与糖结合形成苷的。黄酮类化合物以C6-C3-C6 为基本骨架，根据中间三碳链的氧化程度、苯基连接位置以及三碳链是否呈环状等特点，分为不同的类型。该类成分具有广泛的药理作用，如降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗菌及抗炎等。本实验总共检测到9个黄酮类成分，发酵前有9个，发酵后2个。

在正离子模式下，M14的色谱保留时间为25.46 min，其准分子离子峰[M+H]+为m/z611.159 30，推测其可能的分子式为C27H29O16(误差-2.22×10-6)。m/z611相继脱去1分子鼠李糖基和1分子葡萄糖基生成碎片离子m/z303。同时，二级碎片离子m/z465[M+H-Rha]+和m/z449[M+H-Glc]+的存在，也表明该分子结构中存在鼠李糖(Rha)基团和葡萄糖(Glc)基团。结合对照品比对和文献参考[14]，可将M14准确鉴定为芦丁。

M55的准分子离子峰[M+H]+为m/z287.054 26，其色谱保留时间为42.05 min，其分子式可能为C15H11O6，误差为-2.62×10-6。其二级碎片离子m/z269是由m/z287脱去1分子H2O产生，m/z269进一步脱去1分子CO生成m/z241，表明其结构中存在羟基和羰基。同时，碎片离子m/z165[M+H-C6H6O-CO]+的产生，表明该分子结构中存在羟基和苯环。此外，黄酮母核经逆狄尔斯-阿尔德反应(RDA)重排C环开裂并丢失B环产生碎片离子m/z153[M+H-C6H6O-C2OH]+。结合对照品的保留时间和裂解规律[15]，可将M55准确鉴定为山柰酚。

M20在正离子模式下的色谱保留时间为28.44 min，其准分子离子峰[M+H]+为m/z595.164 06，推测其可能的分子式为C27H31O15，误差为-2.83×10-6。在ESI-MS2图谱中，产生了m/z287、m/z499和m/z577等碎片离子。m/z595脱去1分子Rha生成m/z499，m/z499继续脱去1分子Glc产生m/z287，提示该分子中含有鼠李糖基团和葡萄糖基团。此外，m/z577[M+H-H2O]+的存在表明结构中含有羟基。由此，M20被鉴定为烟花苷(nicotiflorin)。

3.4 生物碱类成分的分析鉴定

黄精和山药中尚含有少量的生物碱类成分，这些化合物药理活性众多，主要为抗肿瘤、抗炎镇痛、抗菌、抗病毒以及杀虫等。本研究鉴定了6个生物碱类化合物，包括发酵前3个和发酵后5个。

在正离子模式下，M1的色谱保留时间为3.43 min，其准分子离子峰[M+H]+为m/z268.103 58，其分子式可能为C10H14N5O4，误差为-1.68×10-6。m/z136和250为其ESI-MS2碎片离子。其中，m/z268丢失1分子D-Rib生成m/z136(表明母核结构中含有核糖)，m/z268丢失1分子H2O产生碎片离子m/z250(表明母核结构中存在羟基)。结合对照品比对，将M1准确鉴定为腺苷。

4 结论

基于UPLC-HRMS技术，本研究对发酵前后黄精覆盆子饮品中的化学成分进行了分析检测。通过分析精确分子量、多级碎片信息，结合对照品和相关文献，本实验共鉴定了60个化学成分，包括42个甾体皂苷，3个三萜，9个黄酮和6个生物碱。这些化学成分有53个来源于黄精，12个来源于覆盆子，2个来源于山药。其中，从发酵前黄精覆盆子饮品中分析鉴定了49个成分，从发酵后黄精覆盆子饮品中分析鉴定了22个成分。结果表明，该饮品中的大多数黄酮类成分和三萜类成分在发酵之后消失；部分甾体皂苷类成分，如化合物康定玉竹苷D1(pratioside D1)，滇黄精皂苷K(kingianoside K)以及黄精皂苷(huangjinoside)D、E、P，新西伯利亚蓼苷D(neosibiricoside D)和它们的同分异构体在发酵后几乎消失；而腺苷、山柰酚、菝葜皂苷元和薯蓣皂苷元等成分在发酵前后均存在。本实验基本阐明了发酵前后黄精覆盆子饮品中的化学成分，可为其化学成分的进一步研究和质量评价提供参考。