新型冠状病毒肺炎病原体诊断技术发展概述

张 雯，黄 鹏

(1.南昌大学公共卫生学院a.2017级； b.循证医学中心； 2.江西省预防医学重点实验室，南昌330006)

2019年12月，中国武汉出现了一种由未知病原体引发的肺炎疫情，随后这种病原体被鉴定为一种新型的冠状病毒。目前，该新型冠状病毒被命名为SARS-CoV-2，引起的肺炎被命名为COVID-19。SARS-CoV-2与过去引起流行的SARS-CoV(SARS冠状病毒)和MERS-CoV(中东呼吸综合征冠状病毒)不同，但同属于β冠状病毒，SARS-CoV-2有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140 nm。从目前掌握的情况来看，SARS-CoV-2的潜伏期为1～14 d，多为3～7 d，以发热、乏力、干咳为主要表现，重型患者多在1周后出现呼吸困难和(或)低氧血症，严重者迅速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍等[1]。本文综述SARS-CoV-2病原学诊断技术的发展，以期为该病的早期发现和诊断提供更多手段。

1 SARS-CoV-2的致病机制

1.1 结合血管紧张素转化酶2(ACE2)

冠状病毒呈不规则形状，直径约60～220 nm。病毒外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白(spike protein，S蛋白)、小包膜糖蛋白(envelope protein，E蛋白)、膜糖蛋白(membrane protein，M蛋白)。冠状病毒的S蛋白分为S1和S2 2个功能单位，S1通过结合宿主受体促进病毒感染，它包括2个结构域，即直接与宿主受体相互作用的N-末端结构域和C-末端结构域[2]。

国内研究[3]表明SARS-CoV-2由呼吸道侵入人体后，通过S-蛋白与人的ACE2结合从而感染呼吸道上皮细胞，其结合力比SARS-CoV高10～20倍，所以传染性更强[3]。ACE2为膜蛋白，在肺毛细血管内皮细胞上有分布[4]。ACE2可将血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)分解为七肽血管紧张素1-7(angiotensin 1-7,Ang 1-7)，Ang 1-7具有舒张血管、抗炎、抗凝、抗纤维化的作用[5]，可以对AngⅡ引起的肺损伤具有保护作用[6-7]。

另外，最新发布的一篇报道[8]显示，在深圳感染的12例患者中，AngⅡ含量明显高于正常人，而且AngⅡ含量与肺损伤程度呈正相关，提示SARS-CoV-2可能与肺的ACE2结合，导致其无法水解AngⅡ，使得肺内血管收缩、纤维化，最终导致肺炎发生。

1.2 引发细胞因子风暴

在SARS-CoV-2感染过程中，观察到的肺组织病理特点是宿主免疫反应加重，其特征是免疫细胞向肺部浸润[9]。学者由此猜测，机体的炎症作用表达极可能是SARS-CoV-2致病重要机制[10]。

细胞因子风暴(cytokine storm)是指机体感染微生物后引起体液中多种细胞因子迅速大量产生的现象，是引起急性呼吸窘迫综合征和多脏器衰竭的重要原因。COVID-19患者从重型向危重型发展时，患者可出现严重低氧血症、继发重型感染，进而发生休克，出现组织灌注障碍，甚至多器官功能衰竭[11]。这可能是因为COVID-19病毒的基因组及抗原性均不同以往的冠状病毒，机体免疫系统对新的、高致病的病原体可能产生了过激免疫应答反应。病毒感染后活化免疫细胞或者非免疫细胞，导致其释放大量细胞因子，这些细胞因子继续加重器官的损伤，患者会表现出一系列临床症状，如高热、肌肉酸痛、精神萎靡等，严重者可表现为血管渗漏效应、低氧血症、多器官毒性表现，甚至危及生命。而血管渗漏效应会持续加重肺泡及肺组织中的渗出，进一步加重低氧血症，一旦形成恶性循环，病情会进一步恶化。

2 SARS-CoV-2的诊断

2.1 分离培养和鉴定

病毒的分离和纯化培养是诊断病毒感染的首要条件。从患者中提取的各种标本(如鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰或肺组织、血液等)进行培养分离得到SARS-CoV-2后，再用电子显微镜技术观察研究病毒颗粒。ZHU等[12]在无菌杯中收集支气管肺泡灌洗液样品，将上清液接种在人气道上皮细胞上。经过三次传代，得到表现出细胞病变作用的人气道上皮细胞。在透射电子显微镜下观察到特异性细胞病变的形态，并用从培养上清液中提取的RNA进行克隆和测序基因组，从而成功地观察和检测出SARS-CoV-2。

病毒的纯化和鉴定为之后进行PCR或者基因测序做出重要铺垫，也使得今后研发病毒疫苗和研制抗病毒药物成为可能。

2.2 核酸检测

根据国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》，规定对于疑似病例，具备以下病原学证据之一者即可确诊：1)实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；2)病毒基因测序与已知的新型冠状病毒高度同源。

2.2.1 实时荧光RT-PCR检测

新型冠状病毒基因序列的获取，使快速开发针对SARS-CoV-2的实时荧光RT-PCR诊断测试成为可能。新型冠状病毒是RNA病毒，病毒中特异性RNA序列是区分该病毒与其他病原体的标志物，因此核酸检测是患者确诊的主要手段。目前采用实时荧光定量PCR技术检测其3个特异性基因：开放读码框架1a/b(ORF1a/b)、核壳蛋白(N)及包膜蛋白(E)基因。其中，ORF1a/b特异性最高，故作为确认靶标[9]。因PCR反应模板仅为DNA，因此采用RT-PCR，即在进行PCR反应前，需将新型冠状病毒核酸(RNA)逆转录为DNA，再进行扩增检测。在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，如果反应体系中存在靶序列，就能发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。病毒核酸浓度越高，荧光定量PCR仪监测的Ct值(即达到设定荧光阈值所需要的循环数)越小。通过荧光定量PCR所得到的样本Ct值的大小，可以知道患者样本中新型冠状病毒的浓度。

实时荧光RT-PCR检测可明显提高检测SARS-CoV-2的特异性和敏感性。该法可用于检测各类型生物样本(血液、痰液、呼吸道分泌物等)中SARS-CoV-2的RNA。但是普通型COVID-19患者随着机体免疫系统的较快激活和增强，体内病毒被清除或抑制在低水平，因此有的病例在早期呈现出SARS-CoV-2核酸检测阴性[13]。而且除呼吸道样本外，COVID-19患者的其他生物样本行SARS-CoV-2核酸检测鲜有报告。

2.2.2 病毒基因测序

与前述RT-PCR相比，高通量测序技术(又称“下一代”测序技术，next-generation sequencing technology，NGS)有着不可替代的显著优势。转录组测序技术(RNA-Seq)可以检测生物体内的RNA病毒、DNA病毒、细菌、真核生物等。RNA-Seq不仅可以检测，而且还能揭示病原体丰度、变异情况、基因表达等信息[14]。RNA-Seq就是把NGS应用到由RNA逆转录生成的cDNA上，从而获得来自不同基因的RNA片段在特定样本中的含量。其基本原理是边合成边测序，即测序过程以DNA单链为模板，在复制过程中合成互补链时，利用带有荧光标记的dNTP发出不同颜色的荧光来确定不同的碱基。用可逆的保护基团封闭新加入dNTP的末端，既保证单次反应只能加入单个碱基，又能在该碱基读取完毕后，将可逆的保护基团除去，使得下一个dNTP连接可继续进行。最后，荧光信号被成像系统所采集，获得目标RNA的碱基序列。若患者支气管肺泡灌洗液或咽拭子中含有与已知的新型冠状病毒高度同源的核酸，则能够确诊。

最近，DI等[15]开发了一种基于Tn5转座酶的转录组测序快速建库方法，该方法缩短了建库的用时，而且需求的样本量较小，可以应用于高质量的单细胞转录组测序，或许能够提升SARS-CoV-2等样本的病毒检出率和速度。总体上看，NGS适用于最初病毒的鉴定和后期病毒的进一步研究，虽然NGS诊断SARS-CoV-2感染者的准确度高，当测序结果与已知SARS-CoV-2序列高度同源时便可确诊，但测序所需时间较长，设备要求较高，不适用于临床快速大批量诊断。

总之，对于SARS-CoV-2核酸检测结果是否准确，需要综合分析样本类型、标本的采集保存与运输(RNA易降解)、患者感染周期等影响因素，了解各种标本中病毒含量以及出现时间的不同，这是确诊SARS-CoV-2感染患者及判断患者恢复的关键。另外，实验室人员操作、核酸提取、试剂盒性能等都能造成检测结果假阴性或假阳性，故实验室需要质量控制与临床评价试验数据进行分析相结合[16-17]。

2.3 血清免疫学检测技术

针对SARS-CoV-2的IgM和IgG抗体，目前已有多家生物公司研发出可供检测的胶体金试剂(免疫层析法)，这为SARS-CoV-2感染的辅助诊断和流行病调查提供了一个极好的检测手段。但比较于核酸检测，免疫胶体金法的敏感度和特异性弱，假阳性率和假阴性率更高。国内深圳亚辉龙等公司已经研发了的化学发光试剂盒，能够用于检测新型冠状病毒IgM、IgG抗体及抗原。该试剂盒能够自动化批量检测，而且可供基层医院使用。血清免疫学检测技术其临床实验室的操作要求相对要低，适用于筛查及流行病学调查，但其病毒检出率还需要进一步提高。有报告[18]显示，血清免疫学检测的灵敏度和特异度分别为88.66%和90.63%。

目前，SARS-CoV-2的现有诊断方法比较见表1。

表1 SARS-CoV-2的现有诊断方法比较

3 SARS-CoV-2的辅助检查

国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》[1]中，建议开展C反应蛋白、降钙素原、铁蛋白、D-二聚体、淋巴细胞总数及亚群、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ等反映机体炎症和免疫状态的指标监测，有助于判断临床进程、预警重症、危重症倾向，并为治疗策略的制订提供依据。

3.1 免疫细胞

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞等。当受到新型冠状病毒感染时，肺炎患者的白细胞下降、淋巴细胞下降、嗜酸性粒细胞下降、T淋巴细胞亚群计数下降(包括CD3、CD4、CD8)，并呈现出骨髓抑制和细胞免疫功能下降的特征[19]。人体样本和动物模型均证实，SARS-CoV-2感染后，肺部可发生单核巨噬细胞和嗜中性粒细胞的堆积，这些细胞正是细胞因子和炎性趋化因子的主要产生来源[20-21]。

WANG等[22]最新发表的关于COVID-19患者尸检病理结果也显示，外周血液样本中，CD4+和CD8+T细胞被过度激活，较高的HLA-DR(CD4 3.47%)与CD38(CD8 39.4%)双阳性比例证实了这一点。CD4+T细胞中具有高度促炎效应的CCR4+CCR6+Th17细胞浓度增高，而CD8+T细胞表现为高浓度的细胞毒性颗粒，从而证实以辅助性T细胞17(helper T cell 17，Th17)的增加和CD8+T细胞的高细胞毒性为表现的T细胞过度活化，导致该患者的严重免疫损伤。

3.2 细胞因子

SARS-CoV-2感染所导致细胞因子风暴原因尚存争议，但研究者通过对同为冠状病毒感染引起的疾病SARS及MERS患者样本及动物模型的研究，发现了一些可能的关键因素。有研究[23-26]发现，SARS-CoV和 MERS-CoV在感染细胞后均能发生快速复制，并在短期内达到高滴度水平。这种病毒早期快速复制模式可引起受感染的肺上皮细胞短期内分泌大量的早期反应细胞因子，而这些早期反应细胞因子会引起炎性细胞大量渗入肺部，引起免疫激化作用[27-28]。当病毒感染入血后，单核/巨噬细胞所释放的细胞因子激活了适应性免疫应答系统，出现免疫级联放大效应，并且随着病毒感染的加重、受累脏器的增多，会增加治疗的复杂程度。因此，检测新型冠状病毒肺炎患者血液中细胞因子水平，能够反映机体炎症程度，可以提前预示病情进展，甚至能成为解除患者急性炎症状态的治疗靶点[9]。

4 结语

目前，检测SARS-CoV-2有多种方法。病原学检测方法(即通过体外培养分离病毒)耗时较长，分离阳性率不高，血清学方法难以对病毒感染进行早期诊断，核酸检测可明显提高检测的特异性和敏感性。综上所述，为应对临床上样本数量多、检测速度快、结果准确等要求，核酸检测仍然是新型冠状病毒的首要检测方法。但是面对临床标本的多样性和复杂性，实际工作中仍然无法避免实验结果的假阴性和假阳性。例如患者的肺泡灌洗液标本粘稠、富含蛋白质、含有自身成分干扰等，这些情况都会给诊断带来一定的困难。因此，临床应用中需取长补短，增强实用性，提高病毒的快速诊断和鉴别诊断的能力。当然，相信随着科研工作的不断深入，将会出现更快更准的方法用于SARS-CoV-2感染的早期发现和临床诊断。