九蒸九制多花黄精炮制过程变化研究

马佳丽 蒋殷盈 蒋福升 李石清 张 婷 袁 强 张春椿

1.浙江中医药大学药学院 杭州 310053 2.浙江中医药大学生命科学院 3.浙江中医药大学医学技术学院

多花黄精（Polygonatum cyrtonema）系百合科黄精属植物，是中药材黄精主要基源之一，为一种重要的野生中药资源。多花黄精为药食同源的多年生草本植物，其味甘、平，归脾、肺、肾经，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效，主要用于脾胃气虚、体倦乏力、口干食少、肺虚咳嗽、劳嗽咳血、精血不足、须发早白、内热消渴等病症[1]。现代研究表明，多花黄精主要含有多糖[2-3]、甾体皂苷[4-5]、黄酮、生物碱、木脂素、果糖[6]、氨基酸[7]等化学成分，具有抗衰老、抗肿瘤、降血糖、降血脂、免疫调节、改善记忆障碍、保护肾功能等多种药理作用[8-13]。

黄精的“九蒸九晒”加工方法始载于《食疗本草》：“饵黄精……可取瓮子，去底，釜上安置，令得所盛黄精，令满，密盖，蒸之，令气溜，即暴之第一遍，蒸之亦如此，九蒸九曝。”[14]经九制的黄精油润软糯，味道甘甜，且储存时间延长，因此，此炮制方法仍延续至今。但九蒸九制的炮制机理和意义尚未进行系统科学诠释且其研究较少。本研究通过对多花黄精炮制过程中物理化学性质、物质含量等变化规律的探索，为多花黄精九蒸九制的优化提供理论依据。

1 试药与仪器

1.1 试药 多花黄精，采集于浙江丽水景宁，经浙江中医药大学药学院张春椿副教授鉴定为百合科黄精属植物多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua的根茎，样品采收后除去泥沙及须根、60℃烘干至恒重；九蒸九制多花黄精（自制）；乙醇分析纯（天津科密欧化学试剂有限公司，批号：20161105）；蒽酮（上海展云化工有限公司，批号：160115）；硫酸（西陇科学股份有限公司，批号：161009）；甲酸（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：090610）；乙腈 （Spectrum Chemical Mfg.Corp，批号：16075051）；5-羟甲基糠醛对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：H12M9Z61023）；娃哈哈纯净水。

1.2 仪器 戴安U3000分析型高效液相（美国赛默飞戴安），Waters XB-C18（250mm×4.6mm，5μm）（JL科技股份有限公司），超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），HC-3618R高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），AL104电子天平 （上海梅特勒-托利多仪器有限公司），UV3300紫外分光光度计 （美国Amersham Biosciences），HH-8数显恒温水浴锅（金坛市城东盛联实验仪器厂），SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 （郑州长城科工贸有限公司），GZX-970 MBE电热鼓风干烘箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），DJ-04中药粉碎机 （上海定久中药机械知道有限公司），FiveEasy Plus pH计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 九蒸九制多花黄精样品及其水提液的制备 挑选大小相近的多花黄精切片，置蒸锅隔层上，多花黄精体质量与水量1:1，隔水蒸4h后取出，放入60℃烘箱中干燥12h，此为“一蒸一制”，标记为PCH1。在此基础上重复循环，直至 “九蒸九制”并标记为多花黄精PCH1-9。同时收集每次蒸制后的剩余水提液，标记为S1-9，装入冻存管中并放至-20℃冰箱保存备用。

2.2 外观、气味、水提液pH、干物质体质量变化结果 分别取100mL多花黄精S1-9批次水提液放置于常温解冻，测定水提液的pH值及蒸干后得到的干物质体质量。随着多花黄精蒸制次数的增多，其颜色会由浅黄变为深棕色接近黑色，其蒸制得到的水提液pH也逐渐减小。不同批次外观、气味、水提液pH、干物质体质量变化结果见表1、图1。

2.3 九蒸九制多花黄精多糖含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取在105℃下干燥至恒重的无水葡萄糖对照品33mg，置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得标准品溶液（每1mL溶液中含无水葡萄糖300μg）。

2.3.2 供试品溶液的制备 样品烘干至恒重，打粉，过60目筛。精密称取各批次样品10.0g，加入80%乙醇回流1h抽滤，再加水100mL，回流2h，趁热抽滤，合并滤液浓缩至50mL，取1mL稀释至200mL容量瓶中，定容。

2.3.3 波长的选择 按照2015版《中国药典》一部黄精多糖检测项下规定，黄精多糖在紫外可见光区582nm处有最大吸收峰[1]，故检测波长设定为582nm。

2.3.4 线性关系考察 分别精密移取对照品溶液0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL 于10mL干燥洁净的具塞刻度试管中，依次加入超纯水使溶液的最终体积为2mL，0.2%蒽酮-硫酸溶液缓缓加入到试管至刻度线，摇匀，紫外分光光度计测定吸光度。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，其回归方程C=39.039x-0.0167（R2=0.9991），表明葡萄糖对照品在0.033～0.0198g·L-1范围内线性关系良好。

2.3.5 精密度考察 精密移取6份0.2mL对照品溶液，按上述方法在波长582nm处测定吸光度。其多糖含量分别为71.13、70.37、71.64、70.88、70.37、71.90mg·g-1，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值为0.90%，表明检测仪器精密度良好符合试验要求。

表1 多花黄精外观、气味、水提液pH、干物质重量Tab.1 Appearance，odor，water extracts pH，dry matter weight of Polygonatum cyrtonema

2.3.6 重复性考察 精密称量6份0.25g多花黄精样品粉末，按照“2.3.2”方法制成样品溶液，测定吸光度。其多糖提取率分别为7.449%、7.297%、7.362%、7.177%、7.377%、7.444%，计算RSD值为1.39%，表明该测定方法的重复性良好。

2.3.7 稳定性考察 取供试品溶液分别于1、2、3、4、5、6h后测定吸光度。其多糖提取率分别为72.16、71.13、72.67、74.21、74.72、73.69mg·g-1，计算RSD值为1.85%，表明供试品溶液在制备后6h内稳定。

2.3.8 加样回收考察 取已知含量的多花黄精粉末1.0g，制备成9份供试品溶液，各按照样品中总多糖含量的80%、100%、120%加入无水葡萄糖对照品，测定吸光度。计算其平均回收率为99.96%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值为0.91%，表明准确度良好。

2.3.9 九蒸九制多花黄精多糖含量测定结果 PCH1-9多糖含量分别为11.60%、6.98%、2.99%、3.04%、3.87%、3.40%、2.96%、3.34%、3.99%。

2.4 5-羟甲基糠醛含量变化

2.4.1 色谱条件 色谱柱（Waters XB-C18，250mm×4.6mm，5μm），柱温为30℃，检测波长为281nm，流动相为A（乙腈）及B（0.1%甲酸-水溶液），两相等度（5:95）洗脱，流速为1.0mL·min-1，进样量为10μL，采用UV检测检测器。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取5-羟甲基糠醛对照品适量，加甲醇溶解，配成浓度为14.17mg·L-1的母液。采用逐级稀释的方法，分别得到浓度为0.4427、0.8854、1.771、3.542、7.083、14.17mg·L-1的 对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 取多花黄精粉末约1g（过3号筛），精密称定，置具塞锥形瓶中，加入60%乙醇20mL，密塞，称重，超声30min，放冷后用60%乙醇补足体质量，摇匀后取1.5mL于离心管中，10000转离心10min，将上清液过膜转移至液相瓶中。

2.4.4 线性关系考察 将“2.4.2”中对照品溶液，精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测得峰面积积分值。以浓度mg·L-1为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为y=16.456x-5.0144（R2=0.9994），结果表明5-羟甲基糠醛在0.4427mg·L-1～14.17mg·L-1的浓度范围内线性关系良好，符合试验要求。

2.4.5 精密度考察 取5-羟甲基糠醛标准品溶液，在上述色谱条件下进行分析，进样6次，每次10μL，测定峰面积并计算RSD为0.82%，表明仪器的精密度良好。

2.4.6 重复性考察 平行称取PCH7的多花黄精粉末6份，按“2.4.3”方法制成样品溶液，精密吸取10μL，在上述色谱条件下进行分析，测定峰面积并计算RSD为0.67%，表明可重复性良好。

2.4.7 稳定性考察 取PCH9的供试品溶液10μL分别于0、2、4、8、12、24h进样测定5-羟甲基糠醛的峰面积并计算RSD为0.41%，表明样品溶液在24h内稳定。

2.4.8 加样回收考察 精密称取已知含量的多花黄精样品粉末，制备成9份供试品溶液，各按照样品中5-HMF含量的80%、100%、120%加入5-羟甲基糠醛对照品，测定峰面积。计算其平均回收率为100.49%，RSD为0.98%，表明准确度良好。

2.4.9 5-羟甲基糠醛含量测定结果 PCH1-9中5-羟甲基糠醛含量分别为0.00619、0.00714、0.00964、0.0180、0.0602、0.109、0.205、0.214、0.277mg·g-1。 5-HMF标准品高效液相色谱图（High Performance Liquid Chromatograph，HPLC）见图2，不同蒸制次数的多花黄精样品HPLC色谱图见图3。

3 分析与讨论

随着多花黄精蒸制次数的增加、时间的延长，外观颜色由浅转深，九蒸九晒的多花黄精呈乌黑色，且微有光泽，质坚且柔软，气味香甜醇厚，表明炮制过程中多花黄精可能发生较为复杂的物理化学变化。文献报道美拉德反应过程中产生新的有色化合物（如类黑素）[15-16]，多花黄精水提液呈弱酸性，九次蒸制后，水提液pH值由5.81下降为3.72，可能原因是美拉德反应会产生的甲酸和乙酸，因此导致水提液酸性增强[17-19]。多花黄精的干物质量在第一次蒸制时含量最多，后面趋于平缓，可能是由于第一次蒸制，细胞吸水膨胀，细胞壁破裂严重，导致开始析出的物质较多，随后几次蒸制逐渐趋于平稳。多糖大都存在于植物细胞壁或细胞内部，随着蒸制时间加长，高温炮制导致细胞中核膜和液泡膜的破裂[28]，也可能是由于黄精炮制后的糖类成分和氨基酸多肽蛋白类成分在高温下发生了十分复杂的美拉德反应所致[20]。七次蒸制的多花黄精的多糖含量达13.51%，而随着继续蒸制，多糖易流失，因此七蒸之后的多糖提取率呈下降趋势[21]。

每一蒸制的多花黄精样品中都检测到5-HMF，且随着蒸制次数变多，其含量逐渐上升。研究表明，5-羟甲基糠醛具有防治神经退行性疾病和抗心肌缺血等作用，但也对黏膜、眼睛、皮肤有刺激性，可与人体蛋白质结合而引起毒性，造成横纹肌麻痹和内脏损害，并且具有神经毒性和潜在的遗传及生殖毒性[22-23]。故通过对九蒸九制过程中5-HMF的含量进行测定，可为多花黄精九蒸九制的优化提供理论依据。

七蒸七制时，多糖含量较高且外观、气味、水提液pH与八蒸八制、九蒸九制时基本无异，同时5-HMF含量也相对较高，这为多花黄精九蒸九制的必要性提供了参考，且为多花黄精发挥最佳功效蒸制次数试验提供了新思路。