瞬时感受器电位-香草素受体4和转化生长因子β1在牙龈瘤中的表达及意义

米会会 沈亚峰 孙斌 陶林 徐江

石河子大学医学院第一附属医院（新疆石河子832000）

牙龈瘤是牙龈局限性慢性炎性增生[1]，具体发生机制不明。根据病理结构牙龈瘤常分为纤维性、肉芽肿性及血管性3型[2]。这种增生与牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，HGFs）、上皮细胞及细胞外基质增多有关。随着我国高血压患病率的增高，服用以钙离子阻滞剂（calcium channel bockers，CCB）为降压药的患者逐渐增多，临床中CCB 诱导的牙龈增生已居药物性牙龈增生（drug-induced gingival overgrowth，DGO）首位[3]。

瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）通道是一种非选择性阳离子通道，参与许多细胞病理生理学变化，与牙龈增生有密切联系[4]。其中，瞬时感受器电位-香草素受体4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）是非选择性能透过Ca2+、Na+等阳离子的发卡状通道[5]。已有研究表明[4，6-7]TRPV4 广泛表达于神经、血管、心脏和肾脏等组织。功能上可被温度、剪切力、渗透压等理化刺激激活，参与多种生理及病理过程[8-9]。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一种与炎症和纤维化相关的因子，广泛表达于心脏、肝脏、肾脏和牙龈等组织中，能够促进牙龈成纤维细胞增殖和胶原纤维（Ⅰ型、Ⅲ型）的合成[10-11]。当前，TRPV4在牙龈瘤中的研究报道较少，本实验通过免疫组织化学染色法探究TRPV4和TGF-β1在牙龈瘤中表达与临床病理参数的关系，以期为牙龈瘤发生、发展机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 组织标本选取石河子大学医学院第一附属医院2010年10月至2018年10月手术切除的牙龈瘤存档石蜡标本共148例（牙龈瘤组C组）；智齿冠周炎患者阻生齿拔除术后炎症牙龈组织47例（炎症牙龈组B组）；另选取29例于我院因美观或修复等原因，行冠延长术患者牙龈组织（正常牙龈组A组）。牙龈瘤全部经病理确诊并分型。其中纤维性、肉芽肿性各50例，血管性48例。牙龈瘤组中，男67例，女81例，平均（46.34±14.23）岁；炎症牙龈组中，男22例，女25例，平均（39.25±12.42）岁；正常组男14例，女15例，平均（28.43±14.03）岁。入选者均知研究目的，及参加研究的潜在危险和利益，且签署知情同意书。

服用硝苯地平的药物性牙龈增生组纳入标准[12]：（1）有高血压病史且服用硝苯地平时间≥6个月；（2）伴有牙龈增生，上下颌前牙区严重；（3）需排除糖尿病等其他全身性疾病；（4）未同时服用苯妥英钠、环孢素A 等其他引起牙龈增生的药物；（5）近6个月未接受过牙周基础治疗；（6）手术前3个月内无抗生素服用史。

排除标准：（1）治疗期间换用非钙离子阻滞剂类降压药物者；（2）口服避孕药者；（3）由非钙诘抗类药物（如苯妥英钠、环孢素A）引起的牙龈增生者。

1.2 主要试剂TRPV4抗体购自英国abcam公司（ab94868），稀释浓度1∶100；TGF-β1抗体购自Affinity公司（af1027），稀释浓度1∶150；免疫组化试剂盒（封闭液、二抗、SAB 复合物以及DAB 显色试剂）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法采用免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法检测。步骤：将牙龈组织标本固定包埋后切片，脱蜡后EDTA 修复抗原，3% H2O2孵育。BSA 处理后分别加入一抗覆盖组织，以PBS为阴性对照4℃过夜后加入相应种属的二抗，孵育漂洗后加入新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察控制显色（阳性染色为棕黄色）。显色完全后冲洗切片，苏木素复染，盐酸酒精分化，氨水反蓝。将干燥透明后的切片封固待观察。

1.4 结果判定由2名病理科副主任医师分别单盲法阅片。采用判定标准[13]：对每张切片的阳性细胞数比例及着色深浅进行计分，以细胞质及细胞膜内出现棕黄色至深棕黄色为阳性，根据着色的强弱程度和阳性细胞所占百分比进行评定和分析。积分数＝阳性染色细胞百分比评分×染色强度评分。阳性染色细胞百分比判定标准：每个标本都随机选择3个高倍视野（× 200），计数阳性细胞数占细胞总数的百分比（阳性细胞百分率）：＜5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；＞75%为4 分。染色强度判定标准为：无着色为0分；淡黄色为1分；黄色为2分；棕黄色为3分；棕褐色为4 分。阳等级：1～4为阴性（-）；5～8分为弱阳性（+）；9～12分为阳性（++）。以（+～++）为阳性，（-）为阴性。

1.5 统计学方法采用IBM SPSS 20.0 统计学软件进行分析，计数资料比较采用χ2检验，行Spearman 相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TRPV4和TGF-β1在不同组织中的表达TRPV4和TGF-β1的在鳞状上皮层中表达由深至浅依次为上皮基底层、棘层、颗粒层及固有层浅层细胞的细胞质中，在间质中主要表达于血管内皮细胞和成纤维细胞的细胞质和细胞膜上，呈浅黄色或棕色颗粒，少量表达于胞核中（图1）。TRPV4在正常牙龈组织、炎症牙龈组织及牙龈瘤组织中的阳性率分别为41.38%（12/29）、48.94%（23/47）和83.11%（123/148），结果差异有统计学意义（P＜0.01，表1）。TGF-β1在正常牙龈组织、炎症牙龈组织及牙龈瘤组织中的阳性率分别为31.03%（9/29）、53.19%（25/47）和85.81%（127/148），差异有统计学意义（P＜0.01，图2）。

2.2 TRPV4和TGF-β1表达与牙龈瘤临床参数关系TRPV4表达与牙龈瘤患者年龄呈显著相关（P＜0.05），且年龄越大，TRPV4表达越低。TGF-β1的表达在牙龈瘤患者年龄方面差异无统计学意义（P＞0.05）。TRPV4和TGF-β1在非药物性牙龈增生的阳性率显著高于药物性牙龈增生，差异有统计学意义（均P＜0.001）。TRPV4和TGF-β1表达在性别、族别方面差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

图1 TRPV4和TGF-β1在正常牙龈组织、炎症牙龈组织和牙龈瘤组织中的表达（×200）Fig.1 Expression of TRPV4 and TGF-β1 in normal gingival tissue，inflammatory gingival tissue and epulis tissues（×200）

2.3 TRPV4和TGF-β1在牙龈瘤病理分型中表达TRPV4和TGF-β1表达均与牙龈瘤病理分型相关（P＜0.05），且均以血管性牙龈瘤阳性率最高，分别为93.75%（45/48）和97.91%（47/48）。而TRPV4中阳性率最低的是肉芽肿性牙龈瘤，其阳性率为70%（35/50），纤维性阳性率为86%（43/50）；TGF-β1中阳性率最低则为纤维性，其阳性率为70%（35/50），肉芽肿性阳性率为90%（45/50）。见表3。

图2 TRPV4与TGF-β1在不同牙龈组织中的表达Fig2 Expression of TRPV4 and TGF-β1 in different gingival tissues

2.4 TRPV4和TGF-β1表达的相关性牙龈瘤组织中TRPV4和TGF-β1的相关性。牙龈瘤组织中TRPV4和TGF-β1表达呈显著正相关（r= 0.391，P＜0.001）。见表4。

3 讨论

TRP 通道于1969年首次于果蝇的视觉系统中被发现[14]，为非选择性阳离子通道，广泛分布于多种生物中。其能被多种刺激激活，如机械牵张、温度变化、氧化应激和炎性因子等[15]，进而激活下游相关阳离子通路，并参与细胞舒缩、增殖及分化等多种病理生理过程。而不同TRP通道对钙离子、镁离子、钠离子、氢离子等的通透选择性不同[16]。TRPV4 广泛表达在神经、消化、呼吸、心血管等系统，可被温度、剪切力、渗透压等理化刺激激活[7-9]，可引起钙离子、钠离子的流动，并主要通过对钙离子的调控及细胞内信号转导通路，产生异构体等不同连接方式，影响细胞增殖、分化、迁移和凋亡等，进而在肿瘤的发生发展中发挥作用[17]。与正常组织细胞比，TRPV4在多数肿瘤细胞中高表达，如肝癌、肺鳞状细胞癌、结直肠癌等[17]；极少数情况下呈低表达，如前列腺癌和食管癌[7]。TGF-β1是组织纤维化中的关键调节因子，它能通过激活下游的Smad 信号，从而促进血管形成、成纤维细胞增生、肌成纤维细胞分化、基质沉积、胶原合成等[18]，尤其在炎症反应、纤维化、组织修复及胚胎发育以及免疫应答调节等病理、生理过程发挥重要作用。WRANA 等[19]研究TGF-β1 对HGFs的影响时发现TGF-β1 能促进细胞的增殖。此外，TGF-β1 能促进牙龈细胞增殖及组织修复。这些均提示TGF-β1能调节HGFs的增殖，影响牙龈组织的损伤与修复。

表2 分析TRPV4与TGF-β1在牙龈瘤中的表达与各临床参数之间的关系Tab.2 Analysis of the relationship between the expression of TRPV4 and TGF-β1 in epulis and various clinical parameters

表3 TRPV4和TGF-β1表达与牙龈瘤病理分型关系Tab.3 Relationship between expression of TRPV4 and TGF-β1 and pathological typing of epulis

表4 牙龈瘤组织中TRPV4与TGF-β1的相关性Tab.4 Correlation between TRPV4 and TGF-β1 in epulis

TRPV4 已被证明在多种组织器官中有表达，但其在口腔中的表达及作用还未见文献报道。如YAMADA 等[20]研究表明，TRPV4 高表达后刺激肝星状细胞增殖，间接诱发肝癌。李孝琼等[21]通过抑制TRPV4表达，能够抑制宫颈癌HeLa 细胞（实验用增殖表皮癌细胞）增殖，并推测TRPV4在宫颈癌HeLa 细胞异常增殖中可能具有负向调控作用。本研究中TRPV4 主要表达在牙龈上皮基底层细胞、内皮细胞和成纤维细胞的细胞膜及细胞质中。TRPV4在正常牙龈组织、炎症牙龈组织及牙龈瘤中表达呈逐渐上升趋势，在牙龈瘤中表达最高。因牙龈瘤是炎症引起的瘤样增生物，笔者推测TRPV4在牙龈瘤发生发展过程中起促进作用。

TGF-β1是由炎症细胞和成纤维细胞等分泌的、与纤维化相关的细胞因子[22]，有研究表明，炎症及细胞因子（如TGF-β1）在牙龈瘤的发生和发展中发挥着重要作用，这与本研究结果一致。本研究中TGF-β1在正常牙龈组织、炎症牙龈组织和牙龈瘤三者中阳性表达率呈逐级上升趋势，且TGF-β1 阳性率在牙龈瘤中较高为86.00%，表明TGF-β1 促进牙龈瘤的发生。

本研究发现TRPV4和TGF-β1表达均与牙龈瘤患者是否为药物性牙龈增生显著相关。TRPV4表达与牙龈瘤患者年龄相关，TGF-β1与之无关。本研究入选的药物性牙龈增生患者以服用钙离子阻滞剂的高血压患者为主，国外资料显示钙通道阻滞剂引起药物性牙龈增生患病率为15%～85%，国内学者报道为20%。钙通道阻滞剂的药理学机制是：作用于冠状血管和周围平滑肌细胞，且能够选择性阻滞细胞膜钙通道，阻止钙离子内流，减少细胞内可利用钙离子。TRPV4是以钙离子为主要透过性阳离子通道，推测钙离子阻滞剂类药物对该通道有抑制作用，从而导致TRPV4在在非药物性牙龈增生中表达显著高于药物性牙龈增生，且差异有统计学意义，而药物性牙龈增生以纤维性居多，本研究结果可为探索药物性牙龈增生的发生机制提供新思路。而随着老龄化社会的进入，高血压患者逐渐增多，服用钙离子阻滞剂的患者也逐渐增加，因此，当年龄越大，药物性牙龈增生患者相对越多，则TRPV4表达就相对越低，恰与药物性牙龈增生与非药物性牙龈增生相比，表达较低结果一致。因此推论TRPV4对药物性牙龈增生有部分抑制作用，对研究药物性牙龈增生中纤维性增生较多有一定意义。

TRPV4主要表达于血管内皮细胞和Ⅱ型肺泡细胞中，少量表达于巨噬细胞、肥大细胞等炎细胞。研究表明，TGF-β1在口腔鳞癌中高表达，对鳞癌血管内皮细胞的增殖作用明显，能够促进肿瘤的形成和增长。而肉芽肿性牙龈瘤中以大量炎细胞及部分新生血管为主，血管性牙龈瘤则以大量成熟血管为主，伴少量炎细胞，纤维性牙龈瘤中以胶原纤维为主，伴少量血管及炎细胞。本研究发现TRPV4和TGF-β1在牙龈瘤中表达呈正相关，且二者均高表达。因此，推测TRPV4和TGF-β1在牙龈瘤的发生发展中起协同作用。

本研究通过免疫组化法分别检测正常牙龈、炎症牙龈、牙龈瘤组织中TRPV4和TGF-β1的表达，结果表明牙龈瘤组TRPV4和TGF-β1 明显高于另外两组，推测TRPV4和TGF-β1在牙龈瘤的发生中起到一定调控作用。TRPV4和TGF-β1在药物所致的牙龈增生中有一定作用，但TRPV4和TGFβ1 调控药物性牙齦增生的具体作用机制还有待进一步探讨。同时，TRPV4和TGF-β1在牙龈瘤中均呈高表达，起协同作用。未来仍需要对TRPV4和TGF-β1在牙龈瘤的多层次不同方向进行研究。