怀山药皮对淇河鲫血清生化、免疫指标及组织结构的影响

胡文攀，吴胜奎，李 衡，曹 慧，孟晓林,2，聂国兴,2

(1.河南师范大学水产学院，河南新乡 453007；2.河南省水产动物工程技术研究中心，河南新乡 453007)

随着科技的进步，集约化养殖程度不断提高，高密度养殖在提升经济效益的同时，也引发了鱼类疾病频发、抗生素滥用等诸多问题[1]，这给水产业健康发展带来了巨大影响。虽然抗生素在预防和治疗水生动物疾病方面效果显著[2]，但长期或过量使用会破坏鱼类机体免疫力，增强病原菌的耐药性，增加鱼体药物残留[3]。中草药含有多种营养素、微量元素和生物活性物质，具有增强免疫力、促进生长、抑菌杀菌、保肝利胆等作用，在鱼类集约化养殖中，已作为新型饲料添加剂替代抗生素广泛使用[4]。

“怀山药”，原产地河南焦作，有“怀参”的美誉，不仅是可食佳肴，也是地道药材。目前，怀山药有效成分的提取工艺以及功能性研究较为广泛[5,6]，但关于山药皮的应用研究尚少，主要集中在成分提取[7，8]，以及食品加工方面[9]。在山药加工过程中山药皮被作为废料丢弃，不但污染环境，而且也是对资源的极大浪费[8]。研究发现，怀山药皮含有薯蓣皂苷、多糖、黄酮、多酚等多种活性成分[10]，其药用价值与山药籽实相当。因此，如何有效利用山药皮，将其进行二次开发利用具有十分重要的意义。

淇河鲫(Carassiusauratus)属鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)鲫属(Carassius)，是河南省特有的珍稀优质鱼类[11]。因肉质鲜美营养价值丰富，深受消费者的喜爱[12]。本研究通过在饲料中添加不同剂量的怀山药皮，研究其对淇河鲫血液生化指标、肝肠组织形态、免疫相关基因表达的影响，旨在为怀山药皮在水产上的开发利用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 实验饲料

实验用添加剂怀山药皮，产自河南省武陟县，山药皮经超微粉碎过60目筛，60 ℃烘干。将怀山药皮分别按基础饲料0.5%、1%和2%的添加量，制成实验饲料。饲料原材料粉碎过筛(60目)，按配方比重拌匀，加油、加水充分混合。混合方法采用多次混合、逐级扩大的方法。用饲料颗粒机(KL-125B)制成粒径2.5 mm的颗粒饲料，晾干后于-20 °C保存备用。基础饲料配方见表1。

1.2 实验设计及饲养管理

实验鱼购自新乡市延津渔场，购回后用20 mg /L的高锰酸钾水溶液药浴10 min，于河南师范大学水产养殖基地循环水系统暂养2周，以基础饲料饱食投喂。正式实验选取健康状况良好的体质量(106.76±3.74)g的淇河鲫240尾。实验分为4组,分别为对照组(NC)、0.5%添加组(LYP)、1%添加组(MYP)和2%添加组(HYP)。每组设3个重复，每个重复20尾鱼，实验养殖8周。按体重3%的量每天投喂4次，分别于每日8 ∶30、11 ∶30、14 ∶30、17 ∶30进行。每日记录摄食情况和死亡数量，每两周进行饲喂量的调整。投喂期间定期检测水质，保证溶解氧高于6 mg/L，氨基氮小于0.01 mg/L。水温控制在(25±1)℃，光照周期为12L ∶12D。

表1 基础饲料组成及营养成分Tab.1 Composition and nutrient composition of base feed

注：1)每kg维生素预混料含：VA 800 000 IU，VB1 1 500 mg，VB21 250 mg，VC 2.5 g，VD3160 000 IU，VE 15 g，VB124 mg，VK3325 mg，VB61 100 mg，肌酸5.5 g，叶酸70 mg，生物素125 mg，烟酸4 g，泛酸4.5 g。2)每千克矿物质预混料含：P 105 g，Ca 330 g，Mg 45 g，Fe 15 g，I 50 mg，Se 9 mg，Cu 0.35 g，Zn 3 g，Mn 1.5 g，Co 11 mg。

1.3 样品采集

养殖实验结束后，将淇河鲫禁食24 h，对每桶实验鱼分别计数和称重。取样前用10 mg/L MS-222溶液对鱼进行麻醉，每个桶中随机选取10尾鱼放在冰盘上解剖，摘取内脏，冲洗干净，截取每条鱼的中肠和肝脏，用PBS冲洗，使用10%福尔马林溶液对组织进行固定。另10条鱼进行尾静脉采血，室温放置2 h后，3 000 r/min的转速，4 ℃离心l5 min，取上清-20 ℃保存；采血后取黄豆粒大小肝脏，1 cm左右中肠，液氮迅速冷冻，放置-80 ℃冰箱保存，用于组织RNA的提取。

1.4 指标测定

1.4.1 生长指标测定

计算肝体比(HIS，%)、脏体比(VSI，%)、特定生长率(SGR，%/d)、增重率(WGR，%)、饲料系数(FCR)、存活率(SR，%)、初始平均体重(IBW)和末平均体重(FBW)。

WGR=(Wt-W0)/W0×100%，

SGR=(lnWt-lnW0)/t×100%，

FCR=WF/(Wt-W0)，

VSI=WV/W×100%，

HIS=WH/W×100%，

式中：Wt为第t天末均重，W0为第0天初始均重，t为实验天数，WF为饲料消耗总量，WV为内脏重量，W为体重，WH为肝胰脏重量。

1.4.2 血清生化指标的测定

采用全自动生化分析仪(AU-5800，BECKMAN)检测血清中谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)的含量。

1.4.3 肝脏、中肠组织病理学观察

采用H.E染色的方法[13]对淇河鲫肝脏及中肠进行组织病理学观察。在对肠道形态进行观察时，选取了中肠肌层厚度和肠绒毛高度作为参考指标。同批次样品连续切片，选取完整的片子进行观察统计，然后取平均值作为每个重复实验鱼肠绒毛高度、肌层厚度的测定数据。

1.4.4 免疫相关基因的表达

基于淇河鲫免疫相关基因cDNA序列，设计正反向引物(见表2)，并以18S rRNA为内参基因。取1 μg总RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa，大连)试剂说明书进行反转录。采用罗氏LightCycle 96®荧光定量PCR仪，参照SYBR®Premix ExTaqTM(Tli RNase Plus)(TaKaRa，大连)说明书进行qRT-PCR扩增。反应体系10 μL：5 μL SYBR®Premix Ex TaqTM(TaKaRa，大连)，0.3 μL PCR Forward Primer(10 μmol/L)，0.3 μL PCR Reverse Primer(10 μmol/L)，1.0 μL cDNA模板，3.4 μL无菌水。扩增程序采用两步法：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环，每个样品3个平行，2-ΔΔCt法计算淇河鲫实验样本中免疫相关基因的相对表达量。

表2 实时荧光定量PCR引物Tab.2 Quantitative real-time PCR primers

1.5 数据处理

实验数据均用“平均值±标准差”表示，用SPSS 19.0软件对数据进行One-Way ANOVA单因素方差分析和Duncan’s多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 山药皮对淇河鲫生长性能的影响

由表3可以看出，与NC组相比，添加山药皮的实验组特定生长率、增重率有升高的趋势，特定生长率分别提高了9.09%、18.18%、4.54%，增重率分别提高了21.96%、27.49%、17.17%，但差异不显著；同时饲料系数与NC组相比有下降趋势,分别为3.37%、0.67%、2.03%，但差异不显著。LYP、MYP和HYP组肝体比、脏体比与NC组相比，无显著差异，但LYP组与MYP组脏体比组间差异显著。

表3 各组淇河鲫的生长指标Tab.3 Growth performance in the C.auratus fed the different diets

2.2 山药皮对淇河鲫血清生化指标的影响

由表4可以看出，与NC组相比，各实验组总蛋白、白蛋白、球蛋白的含量均有升高趋势，但无显著性差异；与NC组相比，谷草转氨酶活性在MYP组显著性降低，碱性磷酸酶活性在MYP组显著性升高；谷丙转氨酶活性在各组间差异不显著。

表4 各组淇河鲫的血清生化指标Tab.4 The values of the blood chemophysiological parameters in the C.auratus in different treatments

注：表中同行数据后标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 山药皮对淇河鲫肝脏组织结构的影响

由图1发现，LYP组与NC组相比，细胞膜与核膜更为完整且核染色质密度升高，同时空泡变性减轻，但效果不明显。MYP组和HYP组肝细胞大小正常且细胞间界限相对较清晰，细胞膜核膜较整齐。

图1 各组淇河鲫肝脏的组织切片(×400)Fig.1 Histological sections of liver of C.auratus in different treatments(×400)NM：细胞核偏移；VD：空泡变性

2.4 山药皮对淇河鲫中肠组织结构的影响

由图2观察发现，MYP和HYP组相较于NC组，肠绒毛结构相对较完整，细胞清晰，绒毛高度和肌层厚度得到提高。通过对切片进行拍照测量得到中肠绒毛高度与肌层厚度的具体数值(表5)。可看出，与NC组相比，各组鲫中肠绒毛高度与肌层厚度有增高趋势但不显著。

图2 各组淇河鲫中肠组织的切片(×100)Fig.2 Histological sections of mid-gut of C.auratus in different treatmentsV：肠绒毛；M：肌层

表5 各组淇河鲫中肠绒毛高度和肌层厚度Tab.5 The villous height and muscular thickness of mid-gut of C.auratus among different treatmentsμm

2.5 山药皮对淇河鲫肝脏免疫相关基因的影响

各实验组肝脏免疫相关基因表达情况如图3所示。可以看出，在淇河鲫肝脏中，与NC组相比，抑炎基因IL-10的表达在HYP组显著上调。CAT、GST的表达量，随添加浓度的升高而升高，与NC组相比，CAT在HYP组具有显著性，GST在MYP和HYP组表达量显著升高。通路相关因子NF-κB与NC组相比表达量下降，在MYP组显著性降低，TLR4在HYP组显著性升高。

图3 各组淇河鲫肝脏免疫相关基因mRNA相对表达量Fig.3 The relative mRNA expression levels of immune-related genes in C.auratus liver in each group“*”代表与对照组相比有显著差异(P<0.05)，图4同。

2.6 山药皮对淇河鲫中肠免疫相关基因的影响

各实验组中肠免疫相关基因表达情况如图4所示。可以看出，在淇河鲫中肠，与NC组相比，炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达量有下降趋势，抑炎基因IL-10的表达量在MYP和HYP组显著上调。对于IL-10，MYP和HYP组表达量分别是NC组的4.5倍、4倍，与其他调控因子相比，实验各组的上调幅度较大。CAT在HYP组显著升高，Claudin-1在LYP和MYP组显著性升高。与NC组相比，TLR4表达水平在MHY组显著升高。

图4 各组淇河鲫中肠免疫相关基因mRNA相对表达量Fig.4 The relative mRNA expression levels of immune-related genes in C.auratus mid-gut in each group

3 讨论

3.1 山药皮对淇河鲫生长指标的影响

山药皮中富含皂甙、黄酮等多种生物活性物质，对机体生长、代谢及免疫力提升均有积极作用。以不同浓度的山药皮粉饲喂肉仔鸡，结果发现不同浓度的添加剂均对其生长无显著性差异[14]。Ekenyem等[15]同样在肉仔鸡中以15%的山药皮粉替代玉米粉，其增重率却显著高于对照及其它剂量组。在水产动物研究中，Lawal等[16]以不同浓度山药皮粉替代玉米粉饲喂革胡子鲶，结论表明山药皮粉对其增重率、饲料转化率及特定生长率均无影响，不能作为玉米粉的有效替代物。乔志刚等[17]在黄河鲤基础饲料中加入质量分数为2%的怀山药，发现其能提高黄河鲤特定生长率、增重率，但效果并不显著，这与本研究山药皮对鲤无明显促生长作用的结果相似。分析山药皮在不同动物上促生长效果差异原因，一方面可能与山药皮中营养物质和饲料配方中的营养配比不同相关，另外鱼类相较于畜禽类，其生长受多方面因素影响，鱼体本身的特异性与环境因素亦会影响到饲料添加剂的作用效果。

3.2 山药皮对淇河鲫血清生化指标的影响

血清生化指标被认为是评价鱼类健康水平的重要指标之一，它的含量和变化规律是动物体重要的生物学特征[18]。肝细胞受损，细胞膜通透性增加，血液中谷丙转氨酶和谷草转氨酶浓度增加，可借谷丙转氨酶和谷草转氨酶的变化评价药物的毒副作用[19]。在本研究中，与NC组相比，添加1%浓度山药皮的实验组鲫鱼血液中谷草转氨酶的活性显著降低。表明在饲料中添加山药皮，可降低淇河鲫血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性，具有保肝的功效。这与陈鹏飞等[20]的研究结果相一致。碱性磷酸酶是消化代谢的关键酶，广泛分布于鱼体的血液、组织以及各个器官，其活性能反映动物体的生长速度以及生产性能[21]。碱性磷酸酶还是重要的解毒系统[22]，在血细胞溶酶体吞噬和包裹病原体时分泌，对外界微生物入侵起水解破坏效果。研究表明，血液中碱性磷酸酶活性提高，可增强机体对病原的识别和吞噬能力，有利于提高畜禽的生长[20]，鲫血清碱性磷酸酶含量高于NC组，说明鱼体的代谢活性增强，利于鱼体的生长。

3.3 山药皮对淇河鲫组织结构的影响

小肠是机体消化、吸收营养物质的主要场所，肠道健康依赖于正常的生理结构，而小肠的肠绒毛长度、肌层厚度则是评价小肠消化吸收能力的重要依据[23]。肠绒毛(intestinal villus)是由固有层和肠上皮细胞向肠腔延伸形成的一个个细小突起，通常呈柱状或指状等。绒毛的长度与肠上皮细胞数量呈正相关。肠绒毛长度增加，肠上皮细胞数增多，消化吸收能力增强，生长发育加快[24]。本研究中，实验组肠绒毛长度及完整性、肌层厚度相较NC组，有一定程度的增加，这表明怀山药皮对鲫肠道营养物质吸收与促生长方面有正向调节作用。本研究中，相同放大倍数下，实验组肝细胞与NC组相比，细胞膜与核膜完整性增强；胞质破碎，核溶解、偏移现象消失，说明添加怀山药皮能一定程度保护并增强肝脏的完整性，作用机制可能与多糖的抗氧化能力相关。在哺乳动物上的研究证实：山药多糖对肝损伤具有免疫保护作用[25-26]。

3.4 山药皮对淇河鲫免疫相关基因的影响

紧密连接蛋白Claudin-1是肠粘膜机械屏障的重要组成部分，在调节上皮细胞通透性、阻碍毒性大分子通过等维护肠道屏障功能方面发挥着关键作用[27]。有研究报道，石斛多糖、岩藻多糖均可上调哺乳动物肠上皮细胞中Claudin-1的mRNA表达量，保护和增强肠上皮细胞功能[28，29]。此外，酚类化合物也可影响紧密蛋白结合的能力，提高肠上皮屏障完整性[30]。本研究中，山药皮的添加增加了Claudin-1在鲫肠道中的mRNA表达水平，表明山药皮的添加可增强对鲫肠道屏障的保护作用。

过氧化氢酶(CAT)是一类末端氧化酶，可通过清除自由基和降低氧化应激，预防、阻止或减少氧化损伤，来保护机体免受疾病的侵袭[31]。而谷胱甘肽转移酶(GST)的作用是保护细胞免受过氧化损伤，维持细胞内氧化还原状态的平衡，防止外界刺激引起的脂质过氧化损伤加剧。本研究中，随着山药皮添加浓度增大，肝脏GST表达量有上升趋势，并且CATmRNA水平显著高于对照组，这说明添加怀山药皮可以增强机体抗氧化能力，减少氧化损伤。

Toll样受体是连接特异性免疫和非特异性免疫的桥梁，能通过增加细胞因子的合成和释放促发炎症反应，其中TLR4是与免疫相关的模式识别受体，可以识别并结合革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖，激活NF-κB信号通路，活化巨噬细胞，诱导炎性细胞因子表达[32]。促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等，在鱼类早期感染和炎症调节中发挥重要作用，可通过炎性反应提高机体抗感染能力。抑炎性细胞因子如IL-10，参与多项免疫调节反应，抑制细胞因子的过度释放，控制炎症过程[33]。有研究表明，多糖作为一种有效的免疫刺激物，直接参与巨噬细胞的活化[34]，通过与靶细胞上的受体结合引起免疫反应，从而提高鱼体的免疫应答和抗病性。在本实验中，添加1%或2%山药皮可一定程度下调鲫肝脏、中肠IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达，上调IL-10、TLR4、NF-κB mRNA表达，表明山药皮有提高机体免疫功能，抑制炎症反应的作用。其机制可能是山药多糖刺激巨噬细胞，通过调节TLR4/NF-κB信号转导通路，下调Th1细胞分泌炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，同时上调Th2抑炎性细胞因子IL-10的表达，平衡Th1/Th2稳态[35]。

综上所述，在饲料中添加怀山药皮，能在一定程度上提高鲫肝脏细胞的完整性、促进肠道肠绒毛长度和肌层厚度增加，对炎性细胞因子起到调控作用，从而增强鲫免疫力，加强肝脏和肠道屏障的保护作用。