羰基铁对小鼠肠道大肠杆菌丰度的影响

苏占会 王俊 谢俊霞

[摘要] 目的 探讨高铁饮食对小鼠肠道大肠杆菌丰度的影响。方法 实验分为正常饮食组和高铁饮食组，其中高铁饮食组小鼠用含质量分数0.03羰基鐵粉的鼠粮喂养。2周后，采用细菌16S rDNA序列扩增和MiSeq测序技术对小鼠新鲜粪便中的大肠杆菌丰度进行分析。结果 与正常饮食组相比，高铁饮食2周后高铁饮食组小鼠新鲜粪便中大肠杆菌丰度显著增加，差异有显著性（U=19.0，P<0.05）。结论 高铁饮食2周可以显著增加小鼠肠道大肠杆菌的丰度。

[关键词] 羰基铁化合物;胃肠道;序列分析，DNA;大肠杆菌;小鼠

[中图分类号] R574.4;R378.21  [文献标志码] A  [文章编号] 2096-5532（2020）02-0137-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.072 [开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.1001.020.html;2020-04-18 16：17

[ABSTRACT] Objective To explore the effect of high-iron diet on the abundance of intestinal Escherichia coli in mice. Methods Mice were divided into normal diet group and high-iron diet group. The mice in the high-iron diet group fed on a diet with a mass fraction of carbonyl iron powder of 0.03. After two weeks， the bacterial 16S rDNA amplification and MiSeq sequencing were used to analyze the abundance of E. coli in the fresh feces of the mice.  Results Compared with the normal diet group， the high-iron diet group showed a significantly increased abundance of E. coli in the fresh feces （U=19.0，P<0.05）.  Conclusion A high-iron diet for two weeks can significantly increase the abundance of E. coli in the intestine of mice.

[KEY WORDS] iron carbonyl compounds; gastrointestinal tract; sequence analysis， DNA; Escherichia coli; mice

铁是细菌生长必不可少的重要因素之一[1]。铁摄入不足和过量都对宿主有害。铁强化和补铁可以提高血浆非转铁蛋白结合铁水平，有利于病原菌生存[2-3]。在大多数情况下，肠道菌群的数量和种类处于相对平衡的状态，可以保护宿主不受病原菌的侵害[4-5]。但是细菌的组成受到很多因素的影响，尤其是饮食成分中包含的金属离子[6-7]。饮食结构决定了肠道细菌的微环境，进而影响了微生物的多样性。此外，铁水平与许多病原体和机会致病菌的毒力直接相关[8-9]。而大部分大肠杆菌（Escherichia coli）通常被看作机会致病菌[10]。铁为致病性细菌生长和毒力的关键调控因子，在高铁条件下未被吸收的铁可以刺激肠道环境中致病菌的生长和增强致病菌的毒性[11-13]。羰基铁粉是一种黑灰色、粉末状还原型元素态铁粉，其铁含量高、钝化后稳定性强，空气中氧化还原性弱，在谷类及其制品、乳粉和特殊食品中已有广泛应用[14]。本研究参考本实验室前期研究用含羰基铁粉的鼠粮喂养小鼠[15]，旨在探讨高铁饮食对小鼠肠道大肠杆菌丰度的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组与处理

SPF级C57BL/6J雄性小鼠20只（8周龄），购自北京维通利华实验技术有限公司，每笼5只饲养于清洁的小鼠房内，保证室温（21±2）℃、湿度（50±5）%、12 h/12 h昼夜光照循环，小鼠可自由饮食[16]。将小鼠随机分为正常饮食组和高铁饮食组，各10只。其中正常饮食组小鼠给予正常饮食喂养，高铁饮食组小鼠用含质量分数为0.03羰基铁粉[15]的高铁鼠粮（由南京协同医药生物工程有限责任公司提供）喂养。动物使用和管理均经青岛大学动物伦理委员会批准。

1.2 粪便样本采集

喂养2周后采集两组小鼠新鲜粪便样本，置于无菌离心管中，并立即置于-80 ℃低温冰箱中保存以便进行后续检测[6]。

1.3 样本DNA抽提和检测

粪便样本中微生物DNA的提取采用 QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒（QIAGEN，Hilden，Germany），按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 细菌16S rDNA序列扩增及MiSeq测序

选取16S rDNA的V4-V5区序列进行高通量测序分析。采用两步聚合酶链式反应（PCR）扩增方法进行文库构建。将纯化的DNA作为模板，利用16S rDNA V4-V5区的通用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）、926R（5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′）以及含有部分Hiseq测序引物和barcode序列的融合引物进行PCR扩增。①第1次PCR反应体系：5×Buffer 10 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，Phusion超保真DNA聚合酶1.0 U，正反向引物（10 mmol/L）各1 μL，模板DNA 20～50 ng，补充超纯水至50 μL。PCR反应条件：94 ℃、2 min;94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s，72 ℃、5 min，25个循环。②第2次PCR反应体系：5×Buffer 8 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，Phusion超保真DNA聚合酶0.8 U，正反向引物（10 mmol/L）各1 μL，模板DNA 5 μL，补充超纯水至40 μL。PCR反应条件：94 ℃、2 min;94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s，72 ℃、5 min，10 ℃保温，8个循环。全部PCR产物采用Axy Prep DNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司产品）进行回收，并应用FTC-3000TM Real-Time PCR仪进行荧光定量，均一化混匀后完成文库构建，采用HiSeq Rapid SBS Kit v2试剂盒，由微基生物科技（上海）有限公司完成illumina MiSeq测序。

1.5 生物信息学分析

测序得到的原始数据通过barcode分配样品reads，得到每个样本的有效序列。采用Trimmo-matic软件，将测序结果末端低质量的序列去掉，根据PE reads之间的overlap关系，采用flash软件将成对的reads拼接成一条序列。采用mothur软件对序列质量进行质控，将模糊碱基、单碱基高重复区、过长和过短的序列以及PCR过程中产生的一些嵌合体去除，得到优化序列。之后进行OTU（ope-rational taxonomic unit）聚类（UPARSE software），将OTU代表序列与Silva 128数据库比对进行物种信息注释。基于分类学信息，在门、纲、目、科、属、种分类水平上进行群落结构的统计分析。

1.6 统计学处理

采用Graph Pad Prism 6.0软件进行统计学处理，所得计量资料数据以±s表示，两独立样本的比较采用非参数Mann-Whitney U检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结  果

正常饮食组和高铁饮食组小鼠新鲜粪便中大肠杆菌丰度值分别为0.000 37±0.000 20和0.008 10±0.003 80（n=10），高铁饮食2周后高铁饮食组小鼠新鲜粪便中大肠杆菌的丰度显著高于正常饮食组，差异有显著性（U=19.0，P<0.05）。

3 讨  论

铁是地球上含量非常丰富的金属（约占地球质量的35%）[17]，对包括大多数细菌在内的几乎所有生物都至关重要[3]。铁过量是铁代谢紊乱的疾病，会导致机体损害。高铁膳食、高铁补品、长期服用铁剂以及临床上长期输血，均会引起体内铁储存过多[18-20]。铁可能会改变病原菌与保护性细菌的比例。细菌定殖依赖于其获取铁和其他营养物质的能力，多种菌株会在结肠中激烈竞争未被吸收的膳食铁[21-22]。在人类、动物和植物中，条件致病菌被称为暂时良性微生物或共生菌，它们在环境变化或宿主压力下可能会导致疾病。大肠杆菌属肠杆菌科，为条件致病菌。BENONI等[23]对大鼠的研究显示，最早在高铁饮食2周后，大肠杆菌的数量有所增加。还有研究表明，贫血的非洲儿童补充铁质后，致病性肠杆菌与保护性双歧杆菌和乳酸菌的比例增加，并伴有反映肠道炎症粪便钙卫蛋白含量的增加[24]。本实验运用细菌16S rDNA序列扩增和MiSeq测序技术，在物种信息的基础上分析了大肠杆菌的丰度变化。结果显示，高铁饮食在短期内可引起小鼠肠道大肠杆菌数量的增多。推测原因可能为：2周的高铁饮食给小鼠肠道造成了一种应激状态，肠道中的细菌无法立即适应，引起肠道的炎症反应，从而引发肠道中机会致病菌如大肠杆菌等的大量繁殖。近年来，关于铁和肠道菌群的研究越来越多，尽管这些研究在动物的选择上以及处理方法上存在很大差异，但可以确定的是，对于大多数肠道革兰阴性菌（如致病大腸杆菌、沙门菌）来说，铁过量吸收在其增殖分化过程中起着至关重要的作用[25]。

综上所述，在高铁饮食2周后，小鼠肠道致病菌大肠杆菌的丰度显著增加，但这对小鼠肠道功能有何种影响还有待进一步研究。

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（本文編辑 马伟平）