菲律宾蛤仔蛋白酶解物的抗氧化活性研究

穆姣姣 赵前程 崔相勇 李建伟 李智博

摘 要：本文研究了5种酶解方式制备的菲律宾蛤仔蛋白酶解液的抗氧化活性，结果表明风味蛋白酶和复合蛋白酶两种酶组合的酶解方式抗氧化活性最高，其羟自由基和[DPPH·]自由基清除率分别为（73.08±1.17）%和（35.18±1.10）%;进一步对该双酶酶解方式进行工艺优化，得到最优酶解工艺条件为：底物浓度1∶3、加酶量1%、酶解时间4 h，在此条件下，蛤蛋白酶解液DPPH自由基清除率为42.68±2.90%。

关键词：菲律宾蛤仔;抗氧化活性;酶解;风味;工艺优化

Abstract：Reseaching the enzymatic method of Ruditapes philippinarum protein showed that the DPPH radicals and hydroxyl radicals scavenging rate of Ruditapes philippinarum protein hydrolysates （by Flavourzyme and Protamex） were 73.08±1.17% and 35.18±1.10%. the hydrolysis conditions of the double-enzyme methods were optimized， and the optimal conditions were as follow： substrate concentration was 1：3， enzyme amount was 1%， time was 4 h. Under this condition， the DPPH radicals scavenging rate was 42.68±2.90%.

Key words：Ruditapes philippinarum; Antioxidant activity; Enzymolysis; Flavor; Process optimization

菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）俗称蚬子，其生长迅速，养殖方法简单，生产周期短、投资少、收益大是滩涂贝类养殖的重要品种之一，且其营养丰富、肉味鲜美，与缢蛏、泥蚶和牡蛎有四大养殖贝类之称[1-3]。我国对菲律宾蛤仔除直接食用外，多是通过简单加工进入食品市场，产品附加值低，其产品内在价值没有被充分有效地利用。如果能从高产量的菲律宾蛤仔及其加工下脚料中，通过酶解等生物手段，从中分离出一些具有抗氧化性质的活性物质，将这种活性物质添加到食品中作为一种天然抗氧化剂或具有抗氧化功能的调味料产品，这将是充分利用菲律宾蛤仔蛋白的一条捷径，将更充分有效地利用蛤类产品本身价值，提高菲律宾蛤仔的附加值，进而促进我国经济发展。

1 材料与方法

1.1 材料

菲律宾蛤仔、复合蛋白酶、碱性内切酶、风味蛋白酶、硫代巴比妥酸、DPPH（2，2-二苯基-1-苦味肼基自由基）、抗坏血酸、脱氧核糖。

1.2 菲律宾蛤仔酶解液的制备[4-6]

将菲律宾蛤仔搅碎后加入去离子水（1∶2，w/v），对菲律宾蛤仔以5种方式进行酶解，见表1：复合蛋白酶（P）;碱性内切酶（A）;风味蛋白酶（F）;复合蛋白酶与风味蛋白酶组合（PF）：先用复合蛋白酶（P）酶解4 h，然后采用风味蛋白酶（F）对酶解液继续进行酶解;碱性内切酶与风味蛋白酶组合（AF）：先用碱性内切酶（A）酶解2 h，然后采用风味蛋白酶（F）对酶解液继续进行酶解。五种方式酶解后，沸水浴100 ℃灭活10 min，8 000 r·min-1离心20 min，取上清液，过滤。以未酶解的蛤蛋白溶液作为空白对照。

1.3 清除[DPPH·]自由基活性测定[7]

配制不同浓度的菲律宾蛤仔蛋白酶解液，取0.1 mL待测样品，加入DPPH标准溶液3.9 mL，当反应达到稳态后，在515 nm下测定各溶液的吸光度值。用0.025 mg·mL-1 DPPH标准溶液做标准曲线，由曲线计算出[DPPH·]清除率为50%时菲律宾蛤仔酶解液的浓度，即为[DPPH·]自由基半抑制率EC50。以抗坏血酸做为阳性对照。

1.4 清除羟自由基活性测定[4]

于试管中加入脱氧核糖溶液0.2 mL（10 mmol·L-1）、磷酸钠缓冲液1 mL（pH 7.4，0.2 mol·L-1）、硫酸亚铁-EDTA溶液0.2 mL（10 mmol·L-1）、样品溶液0.4 mL和蒸馏水2 mL，然后继续加入过氧化氢0.2 mL（10 mmol·L-1）啟动反应。将试管置于37 ℃水浴中1 h，然后加入三氯乙酸1 mL（2.8%）和硫代巴比妥酸1 mL（1%），于沸水浴中放置10 min，取出后立即放入冰浴中5 min。然后在532 nm下测定吸光度。计算出半抑制率EC50。以抗坏血酸做为阳性对照。

1.5 酶解条件单因素试验

其他酶解条件不变，分别改变酶解时间（1、2、3、4 h和5 h）、底物浓度（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5）和加酶量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%）测定菲律宾蛤仔酶解液的抗氧化活性。

1.6 正交试验

以DPPH自由基清除率作为抗氧化活性评价指标，根据酶解条件单因素实验结果，对酶解时间、加酶量和底物浓度进行正交试验，三因素三水平设计如表2所示。

2.1 菲律宾蛤仔5种酶解液的抗氧化活性比较分析

5种酶解方式制备的菲律宾蛤仔蛋白酶解液及空白对照的抗氧化活性如表3所示，酶解液的抗氧化活性显著（p<0.05）高于空白对照;复合蛋白酶与风味蛋白酶组合方式制备的酶解液羟自由基和[DPPH·]自由基清除率显著高于其他方式的酶解液（p<0.05），分别为（35.18±1.10）%和（73.08±1.17）%;通过对复合蛋白酶制备的蛋白酶解物再进一步采用风味蛋白酶处理，不仅提高了风味，而且[DPPH·]自由基清除活性显著增强。

2.2 菲律賓蛤仔酶解工艺优化

5种酶解方式制备的菲律宾蛤仔蛋白酶解液经过自由基清除率比较，复合蛋白酶+风味蛋白酶的自由基清除率及风味最好，因此，对此种酶解方式制备的蛤蛋白酶解物进行工艺优化。考虑到双酶组合的酶解过程中，酶解液的自由基清除率是由复合蛋白酶起主要作用，因此，对双酶组合中的复合蛋白酶酶解工艺条件进行优化。

2.2.1 酶解时间对菲律宾蛤仔蛋白酶解液抗氧化活性的影响

由图1知，酶解时间为3 h，[DPPH·]自由基清除率最高，因此，酶解时间选择3 h。

2.2.2 底物浓度对菲律宾蛤仔蛋白酶解液抗氧化活性的影响

由图2知，底物浓度为1∶3时，[DPPH·]自由基清除率最高，因此，最佳底物浓度选择1∶3。

2.2.3 加酶量对菲律宾蛤仔蛋白酶解液抗氧化活性的影响

由图3知，当加酶量为0.8%时，[DPPH·]自由基清除率最高，因此，加酶量选择0.8%。

2.2.4 正交试验

根据单因素试验，确立了最佳复合蛋白酶酶解条件，在此基础上，以[DPPH·]自由基清除率为指标，对酶解时间、底物浓度和加酶量进行三因素三水平正交试验，结果见表4。由表4知，[DPPH·]自由基清除率的影响因素为酶解由大到小依次为酶解时间、底物浓度和加酶量。由k值得最佳组合为A2B3C3，即酶解时间4 h，底物浓度1∶3，加酶量1%，在此条件下，[DPPH·]自由基清除率是（42.68±2.90）%。

3 结论

酶解方式对菲律宾蛤仔蛋白酶解物抗氧化活性有明显的影响。复合蛋白酶与风味蛋白酶组合双酶酶解方式制备的菲律宾蛤仔蛋白酶解物的[DPPH·]自由基和羟自由基清除率分别为（35.18±1.10）%和（73.08±1.17）%;最优酶解工艺条件为：底物浓度1∶3，加酶量1%，酶解时间4 h，在此条件下，蛤蛋白酶解液[DPPH·]自由基清除率为（42.68±2.90）%。

参考文献：

[1]张榭令，姜仕臣，丛裕泉，等.山东蓬莱菲律宾蛤仔资源调查研究[J].海洋湖沼通报，2007（4）：151-156.

[2]杜尚昆，边永德，柳中锋.菲律宾蛤仔工厂化育苗技术[J].渔业现代化，2005（3）：24-25.

[3]陶 平，许庆陵，谭淑荣.大连沿海几种腹足类和双壳类的营养成分分析[J].辽宁师范大学学报（自然科学版），2000（2）：182-186.

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[6]Tsai J S，Lin T C，Chen J L，et al.The inhibitory effects of freshwater clam （Corbicula fluminea， Muller） muscle protein hydrolysates on angiotensin I converting enzyme[J].Process Biochemistry，2006，41：2276-2281.

[7]Brand-Williams W，Cuvelier M E，Berset C.Use of a Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity[J].LWT-Food Science and Technology，1995，28（1）：25-30.