Cf-2/Rcr3pim番茄品系对南方根结线虫的抗性测定

丁修恒 王暄 李红梅 周仁鹏 陈聪

摘要 Cf-2/Rcr3pim基因型番茄不仅能够抵御番茄叶霉菌的侵染，而且对马铃薯金线虫的寄生也有一定的抑制效果。为挖掘根结线虫的新抗性资源，本研究采用室内人工接种法测定了Cf-0/Rcr3pim、Cf-2/Rcr3-3和Cf-2/Rcr3pim 基因型番茄品系对南方根结线虫的抗感性。抗性评价结果显示，Cf-0/Rcr3pim 品系对南方根结线虫表现高感，Cf-2/Rcr3-3品系为中感，而Cf-2/Rcr3pim品系则为感病。与Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3-3基因型相比，Cf-2/Rcr3pim基因型番茄品系虽然对南方根结线虫侵染的敏感性略低，但是不能阻止线虫在根系上的大量繁殖，不适于根结线虫的防控应用。

关键词 南方根结线虫; Cf-2/Rcr3pim 基因型; 抗性测定; 人工接种; 根结指数

中图分类号： S 436.412， S 432.45

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019130

Evaluation of resistance in tomato lines with genotype

Cf-2/Rcr3pim to Meloidogyne incognita

DING Xiuheng， WANG Xuan， LI Hongmei， ZHOU Renpeng， CHEN Cong

（Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests， Ministry of

Education， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract

The Cf-2/Rcr3pim genotype tomato can not only resist the infection of Cladosporium fulvum， but also can inhibit the parasitism of Globodera rostochiensis. In order to explore the new resistant resources for root-knot nematodes， the resistance of Cf-0/Rcr3pim， Cf-2/Rcr3-3 and Cf-2/Rcr3pim genotype tomato lines to Meloidogyne incognita was determined by the greenhouse inoculation test. The resistance evaluation showed that the Cf-0/Rcr3pim line was highly susceptible to M.incognita， while the Cf-2/Rcr3-3 line was moderately susceptible， and the Cf-2/Rcr3pim line was susceptible. Although Cf-2/Rcr3pim genotype tomato line was less susceptible to the infection of M.incognita when compared with the Cf-0/Rcr3pim and Cf-2/Rcr3-3 lines， it failed to prevent the mass reproduction of nematodes on the roots， indicating it is unsuitable for root-knot nematodes control.

Key words

Meloidogyne incognita; Cf-2/Rcr3pim genotype; resistance evaluation; artificial inoculation; gall index

根结线虫Meloidogyne spp.是一类重要的植物寄生线虫，侵染的植物种类达3 000种以上[1]，严重危害农作物的产量和品质，每年造成全球作物经济损失高达100亿美元[2]。根结线虫已报道的种类达98个[3]，其中，分布广泛、危害严重的种类主要有南方根结线虫 M.incognita、花生根结线虫 M.arenaria、爪哇根结线虫 M.javanica和北方根结线虫M.hapla等4种[4]。根结线虫的防治，对于稳定粮食安全和保障人类生活品质都具有重要的意义。

根结线虫的综合治理策略包括植物检疫、农业防治、物理防治、生物防治、抗性品种利用以及化学防治等，其中，种植抗性品种是最为经济有效的防治手段，许多国家对根结线虫的抗性育种和品种选育工作都非常重视[5]。虽然根结线虫的抗性基因在多种作物中都有报道，但真正应用于农业生产的抗性资源仍然十分有限。目前商业化应用最为成功的是Mi-1基因[67]，该基因源自野生秘鲁番茄Solanum peruvianum，对南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3个种均有抗性[8]。然而，单一抗源品种如果长期连续种植，极易造成根结线虫突破Mi-1基因抗性而成為毒性群体，导致品种抗性丧失[911]，此外，Mi-1基因在土壤温度高于28℃时就会丧失对根结线虫的抗性，不利于保护地栽培以及夏季高温炎热地区的农作物种植[1213]，因此，发掘根结线虫新的抗性资源和材料对根结线虫防控尤为迫切。

Cf-2/Rcr3pim是来自醋栗番茄Solanum pimpinellifolium的一对基因，Cf-2/Rcr3pim共同介导了番茄对叶霉菌Cladosporium fulvum的抗性，其作用机制符合“警戒假说（guard hypothesis）”，即木瓜类半胱氨酸蛋白酶（papain-like cysteine proteases，PLCPs）Rcr3pim能够识别叶霉菌无毒蛋白Avr2，从而激发Cf-2介导的番茄对叶霉菌的抗性[14]。Cf-2/Rcr3pim番茄在防御马铃薯金线虫Globodera rostochiensis侵染的过程中也具有相似的作用，即马铃薯金线虫分泌一种类毒液过敏原蛋白（venom allergen-like protein，VAP）GrVAP1，番茄的Rcr3pim能够与GrVAP1特异性地结合，激发Cf-2介导的抗性反应，进而有效减少马铃薯金线虫成功侵染的数量[15]。

已有研究证实根结线虫同样分泌VAP蛋白[1617]，Cf-2/Rcr3pim番茄是否能够利用上述类似机制来抵抗根结线虫的侵染目前尚不明确，本文以Cf-2/Rcr3pim基因的3个不同番茄品系为研究材料，测定其对南方根结线虫的抗感性，以期为发掘根结线虫的新抗源提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试番茄品系Cf-0/Rcr3pim、Cf-2/Rcr3-3、Cf-2/Rcr3pim分别为番茄品种‘MoneyMaker的3种不同基因型[15]，由荷兰瓦赫宁根大学Jose L. Lozano Torres博士馈赠，表达Mi-1基因抗性番茄品种‘Tanaki由比利时国家农业渔业研究所（ILVO）Nancy de Sutter女士馈赠，番茄感病品种‘Hezuo903购自江苏省农业科学院。

将供试番茄种子分别浸泡在5.32×10-5mol/L NaClO 溶液中消毒 2 min后，用无菌水清洗5次，置于25℃垫有湿润滤纸的培养皿中催芽。3 d后将发芽的种子播种于盛有灭菌土（土∶细沙∶营养土=3∶3∶1）的塑料杯中 （直径7 cm×高度12 cm），20～25℃日光温室培养番茄至6叶期，用于RNA提取和线虫接种。

供试南方根结线虫群体采自江苏省淮安市丁集镇的黄瓜根部，经单卵块纯化及种类鉴定后，接种于感病番茄‘Hezuo903，置于25℃日光温室繁殖。45 d后收集番茄根部的卵块，置于25℃培养箱，收集孵化的2龄幼虫制成悬浮液，用于线虫的接种。

1.2 番茄材料的Cf-2和Rcr3pim基因检测

采用RT-PCR法对供试番茄材料进行基因型检测。取6叶期植株的根系，用Plant RNA Kit （Omega，USA）提取根系的总RNA，用5×All-In-One RT MasterMix试剂盒（abm， Canada）将总RNA反转录合成cDNA，提取和反转录按试剂盒说明进行操作。以番茄根系cDNA为模板，用Cf-2基因的特异性引物Cf-2Fw/Cf-2Rv[15]和Rcr3pim基因的Rcr3pimf/Rcr3r[18]进行RT-PCR检测，以番茄actin基因（1 084 bp）为内参[15]（表1）。RT-PCR反应体系：2×Ex Taq mix 12.5 μL、正反向特异性引物各2 μL和模板1 μL，加双蒸水定容至25 μL。扩增条件：95℃预变性4 min;95℃变性30 s，60～65℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，循环35次;最后72℃延伸10 min。用15 g/L琼脂糖凝胶电泳30 min（电压120 V），溴化乙锭染色15 min后，在凝胶成像系统下观察并拍照。

1.3 测定番茄材料对根结线虫抗感性

参照戴均涛等[19]的方法测定供试番茄材料对根结线虫的抗感性。接种线虫前，在6叶期番茄距离苗茎基部2 cm处土壤均勻打4～6 cm深的小孔4个，每孔各接100条2龄幼虫（J2），每株苗接种400条J2。各番茄材料设6个重复。将接种后的番茄幼苗置于20～25℃温室中，正常光照，定期浇施营养液。

接种45 d后，从塑料杯中取出番茄植株，剪去地上部，洗净根系后，用1.04×10-4 mol/L台盼蓝（Trypan Blue）溶液浸泡 20 min，清水洗去多余染色液后用吸水纸吸干，分别统计每株番茄根系上的根结数、卵块数以及有根结的根在总根系中的占比。从每株番茄根系上随机挑取6个卵块，置于含有5.32×10-5mol/L NaClO 溶液的12孔板中，在体视镜（SMZ-168）下统计单卵块中的卵量;每品系重复3次。用酸性品红染色法[20]对上述根系染色，在体视镜下统计根内雌虫数;每品系重复3次。

番茄抗根结线虫的评价分级标准参照王新荣等[21]的方法， 即根据番茄形成根结的根数占整个根系的百分比（根结率），将番茄抗根结线虫等级分为6 级：0级，免疫（I，根结率为0）;1级，高抗（HR，根结率为1%～5%）;2级，抗病（R，根结率为6%～25%）;3级，感病（S，根结率为26%～50%）;4级，中感（MS，根结率为51%～80%）;5级，高感（HS，根结率>81%）。根结指数的计算公式为：根结指数=∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高严重度代表值）×100。

1.4 数据分析

采用SPSS 10.0进行数据处理，用Duncan氏新复级差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 番茄材料的Cf-2和Rcr3pim基因检测

为了确认Cf-2/Rcr3pim、Cf-2/Rcr3-3和Cf-0/Rcr3pim基因型番茄品系中的Cf-2和Rcr3pim基因表达水平是否有差异，我们以番茄actin基因为内参，用表1的Cf-2和Rcr3pim基因特异性引物对供试番茄材料进行检测。结果显示，从Cf-2/Rcr3pim品系中能分别扩增出约370 bp和400 bp的片段，与预测片段大小一致，表明Cf-2和Rcr3pim基因在根系组织中均有表达，其中Cf-2表达水平相对较低;从Cf-2/Rcr3-3品系中仅扩增出约370 bp的Cf-2基因片段，没有扩增出Rcr3pim基因的片段;从Cf-0/Rcr3pim品系中仅能扩增出约400 bp的Rcr3pim基因片段，未检测到Cf-2基因的表达;而从根结线虫感病番茄‘Hezuo903和抗病番茄‘Tanaki中均未检测到Cf-2和Rcr3pim基因的表达（图1）。

2.2 番茄材料的根结线虫繁殖情况统计

接种南方根结线虫45 d后，观察不同番茄品系上的线虫繁殖情况并进行统计分析，结果显示，仅表达Rcr3pim基因的Cf-0/Rcr3pim品系形成根结数量最多，平均为180.6个/株， 仅表达Cf-2基因的‘Cf-2/Rcr3-3品系形成的根结数为145.1个/株，而同时表达Cf-2和Rcr3pim基因的Cf-2/Rcr3pim品系形成的根结最少，仅为101.3个/株;感病对照‘Hezuo903形成根结数为144.4个/株，抗病对照‘Tanaki的根结数仅为5.3个/株。Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3pim与感病和抗病对照相比均呈现显著性差异（P<0.05）;而Cf-2/Rcr3-3品系与感病对照无显著差异（P>0.05），与抗病对照相比则差异显著（P<0.05）（图2a）。

观察并统计根系上的雌虫数及卵块数，均显示与上述相类似的结果（图2b，c），Cf-0/Rcr3pim、Cf-2/Rcr3-3和Cf-2/Rcr3pim根系上的平均雌虫数分别为249.0、210.0和125.3个/株，卵块数分别为134.6、110.0和71.3个/株，而感病对照‘Hezuo903的雌虫数为196.7个/株，卵块数为103.7个/株，抗病对照‘Tanaki根内雌虫数仅为1.7个/株，无卵块。Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3pim品系在雌虫数及卵块数上与感病和抗病对照相比均有显著差异（P<0.05），而Cf-2/Rcr3-3品系仅与抗病对照差异显著（P<0.05）。

番茄根系上单个卵块的卵量统计结果（图2d）显示，Cf-0/Rcr3pim、Cf-2/Rcr3-3和Cf-2/Rcr3pim品系的单卵块卵量分别为442.1、428.2粒和303.6粒，而感病对照‘Hezuo903的卵量高达448.2粒。Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3-3品系与感病对照相比均无显著差异，而Cf-2/Rcr3pim品系与感病对照差异显著（P<0.05）。

上述结果表明，与感病对照相比，Cf-2与Rcr3pim基因的分别在Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3-3品系中表达并未明显影响南方根结线虫的寄生，而两种基因同时在Cf-2/Rcr3pim品系中表达能够显著减少南方根结线虫在根系上的繁殖量。

2.3 Cf-2/Rcr3pim番茄材料的根结线虫抗性评价

统计各番茄接种处理的根结率及根结指数，结果（表2）显示，抗病对照‘Tanaki的根结率和根结指数最低，分别为1.79%和20.00，抗性评价为高抗（HR），感病对照‘Hezuo903的根结率和根结指数分别为50.25%和70.00，评价为中感（MS）。Cf-0/Rcr3pim、Cf-2/Rcr3-3和Cf-2/Rcr3pim品系的根结率分别为81.27%、56.45%和39.84%，根结指数均≥60.00，抗性评价分别为高感 （HS）、中感（MS）和感病（S）;3个番茄品系的根结率和根结指数与抗病对照相比均差异显著，其中仅Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3pim品系与感病对照差异显著（P<0.05）。

3 结论与讨论

Cf-2/Rcr3pim基因对组合对番茄叶霉菌具有较好的抗性[14]，同时也能够抑制致病疫霉Phytophthora infestans及马铃薯金线虫的侵染[15， 22]。为了发掘根结线虫的新抗源材料，本文通过室内人工接種法测定了Cf-2/Rcr3pim番茄不同品系对南方根结线虫的抗性，所用品系包括Cf-2/Rcr3pim品系、Rcr3pim基因突变品系Cf-2/Rcr3-3以及杂交品系Cf-0/Rcr3pim[15]。结果证实：与分别表达Cf-2与Rcr3pim基因的Cf-2/Rcr3-3 和Cf-0/Rcr3pim品系相比，同时表达两种基因的Cf-2/Rcr3pim品系根上的根结数、雌虫数及卵块数量明显较少，表明该品系能够一定程度上减少线虫的侵染。Rcr3pim被认为是病原物侵染番茄的一类重要毒性靶标，当不存在Cf-2基因时，叶霉菌及马铃薯金线虫能够分别利用无毒蛋白Avr2和效应蛋白GrVAP1通过与Rcr3pim互作抑制植物的防卫反应进而促进侵染[15];本研究结果也同样证实了仅表达Rcr3pim基因的Cf-0/Rcr3pim品系相比其他两个品系对南方根结线虫更为敏感，而Rcr3pim介导的不同病原物的毒性机制仍有待今后进一步深入研究。

为了进一步评估Cf-2/Rcr3pim番茄不同品系对南方根结线虫的抗性，本文以‘Tanaki和 ‘Hezuo903两个品种分别作为抗、感对照。‘Tanaki是表达Mi-1基因的商业化番茄品种，Mi-1基因对根结线虫的抗性主要表现为产生过敏性坏死反应，导致根结线虫侵入位点的细胞发生坏死，从而限制线虫的取食，抑制其生长发育和繁殖[23]。而本文结果表明，虽然 Cf-2和Rcr3pim基因同时表达的Cf-2/Rcr3pim品系与其他两个品系相比在一定程度上减少了成功侵染的线虫数量，但并不能够有效抑制线虫的生长和发育，Cf-2/Rcr3pim品系的根结率及根结指数与感病对照‘Hezuo903相接近，仍为感病品种。此外，我们发现Cf-2/Rcr3pim番茄品系根系中侵入线虫所产生的卵量明显下降，比Cf-0/Rcr3pim和Cf-2/Rcr3-3番茄品系减少约30%，推测其原因可能是线虫的侵染激活了Cf-2/Rcr3pim介导的番茄基础防卫反应，在减少成功侵染的线虫数量的同时，也对线虫生长发育产生一定的影响，从而导致其产卵时间滞后或减少。

Cf-2/Rcr3pim番茄品系能够抵抗叶霉病菌的侵染，本研究证实，Cf-2/Rcr3pim品系番茄对南方根结线虫没有抗性，不适用于根结线虫的抗病育种。

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（责任编辑：杨明丽）

收稿日期： 20190315   修订日期： 20190402

基金项目：国家自然科学基金（31872923）

致  谢： 参加本试验部分工作的还有江代礼、谭翰杰、张能和纪烨斌等同学，特此一并致谢。

通信作者E-mail：lihm@njau.edu.cn

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