灭字脊虎天牛CSP基因的鉴定、表达谱及XquaCSP7基因的功能研究

庄翔麟 吉帅帅 赵昱杰 尹宁娜 刘乃勇

摘要 基于已發表的灭字脊虎天牛Xylotrechus quadripes的触角转录组数据，采用BLAST同源搜索的方法从转录组中一共鉴定到14个CSP基因，所有CSP均具有全长序列、信号肽序列和4个保守的半胱氨酸。序列比对结果表明，灭字脊虎天牛CSP间氨基酸一致性差异较大（12%～73%），平均值为34%;具有C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4的半胱氨酸保守模式。进化分析表明，除XquaCSP8和XquaCSP12外，其余XquaCSPs聚类到不同分支。表达谱分析表明，XquaCSP7基因在触角特异表达;XquaCSP4、CSP5、CSP12和CSP14基因在触角高表达;XquaCSP13基因在足特异表达;其余XquaCSPs基因在多个组织中有表达。结合测定结果发现，XquaCSP7与测试的21种寄主气味结合能力均较弱，荧光取代率在4.5%～13.5%之间，其中与苯乙酮的结合能力最强，荧光取代率为13.5%。研究结果可为后续灭字脊虎天牛CSP基因的功能研究奠定基础。

关键词 灭字脊虎天牛; 化学感受蛋白; 基因鉴定; 表达谱; 荧光竞争性结合测定

中图分类号： S 433.5

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019123

Identification and expression pattern of chemosensory protein genes

from Xylotrechus quadripes Chevrolat （Coleoptera： Cerambycidae） and

functional studies of XquaCSP7 gene

ZHUANG Xianglin1， JI Shuaishuai1，2， ZHAO Yujie1， YIN Ningna1， LIU Naiyong1

（1. Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province， Southwest Forestry University， Kunming

650224， China; 2. Deyang Administration Branch of Giant Panda National Park， Deyang 618000， China）

Abstract

In this study， we identified 14 chemosensory protein genes from the antennal transcriptome of Xylotrechus quadripes by using a BLAST homology-based approach. All identified XquaCSPs had full-length sequences with signal peptides and four conserved cysteines. Sequence alignment results showed a varied amino acid identities with a range of 12%-73% （mean： 34%） among XquaCSPs. A conserved cysteine pattern of C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4 was presented among XquaCSPs. Phylogenetic analysis indicated that XquaCSP8 and XquaCSP12 were grouped into a small clade and others were classified into different clades. Expression pattern analysis revealed that XquaCSP7 showed an antennae-specific expression， while XquaCSP4， CSP5， CSP12 and CSP14 were highly expressed in the antennae; XquaCSP13 expression was limited to legs. The remaining XquaCSP genes had a broad expression in various tissues. Binding assays showed that XquaCSP7 exhibited weak binding affinities to 21 odorants derived from host plants， with a range of fluorescent displacements of 4.5%-13.5%. Among these， acetophenone was the best ligand with a fluorescent displacement of 13.5%. The results laid a foundation for future functional studies of XquaCSP genes in this species.

Key words

Xylotrechus quadripes; chemosensory protein; gene identification; expression pattern; fluorescence competitive binding assay

云南省是我国小粒咖啡Coffea arabica Linn.的主产区，种植面积和产量均居全国之首[1]。长期以来，灭字脊虎天牛Xylotrechus quadripes严重威胁和制约云南省小粒咖啡产业的发展，有学者对定植5年的小粒咖啡調查发现灭字脊虎天牛为害率高达80.6%[2]。该虫隶属于鞘翅目Coleoptera，天牛科Cerambycidae，天牛亚科Cerambycinae，主要以幼虫蛀食小粒咖啡树干，为害较为隐蔽，目前主要采取人工捕杀幼虫、成虫和喷洒化学农药等方法进行防治，成本高昂且防治效果不理想，亟待研发新型的绿色防治技术[3]。

触角是天牛等昆虫的重要嗅觉感受器官，其表面着生有不同类型的感器，感器内部的淋巴液中有两种参与识别和运输气味分子的嗅觉蛋白：气味结合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）和化学感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）[46]。昆虫CSP是一类小分子可溶性蛋白，分子质量约为15～17 kDa，一般多肽链全长100～120个氨基酸，具有4个保守的半胱氨酸残基（cysteine，Cys），能够形成两对二硫键，起稳定蛋白三级结构的作用[5，78]。1994年，在黑腹果蝇Drosophila melanogaster触角中分别发现OS-D（olfactory specific-D）和A-10两个CSP基因，这也是在昆虫触角中最早发现的CSP基因[910]。近年来，随着分子生物学技术的不断发展以及转录组和基因组测序技术的不断更新，大量昆虫的CSP基因已被鉴定，如在鞘翅目昆虫云斑天牛Batocera horsfieldi[11]、红脂大小蠹Dendroctonus valens[12]、松褐天牛Monochamus alternatus[13]、光肩星天牛Anoplophora glabripennis[14]、星天牛A.chinensis[15]和赤拟谷盗Tribolium castaneum[16]中分别鉴定到3、6、12、12、16和20个CSP基因;在非鞘翅目昆虫家蚕Bombyx mori[8，17]、棉铃虫Helicoverpa armigera[18]、黑腹果蝇和意大利蜜蜂Apis mellifera[8]中分别鉴定到22、29、4和6个CSP基因。另外，研究发现昆虫的CSP基因在触角、头、胸、腹、足、翅、下唇须等多个组织中均有表达，说明其功能具有多样性[6，1417，19]。目前，一般认为昆虫的CSP具有嗅觉感受、运输气味分子、发育和免疫调节等功能[2021]，如日本弓背蚁Camponotus japonicus的CjapCSP能够特异性识别非同种巢穴蚂蚁表皮的烃类物质[22];2007年，Maleszka等人利用RNAi技术证明意大利蜜蜂的AmelCSP5基因参与了胚胎覆盖膜的形成[23]。

在昆虫体外，荧光竞争性结合测定技术被广泛用于研究CSP和气味分子的结合能力，如华山松大小蠹Dendroctonus armandi的DarmCSP2与月桂烯和3-蒈烯具有较强的结合能力[24]。苜蓿盲蝽Adelphocoris lineolatus的AlinCSP1-3与顺-3-己烯-1-醇、2-己烯醛和戊二醛具有较强的结合能力[25]。据此研究CSP与气味分子（植物挥发物和性信息素）的结合能力，结合电生理测定、室内行为学研究和田间诱捕试验，在筛选到害虫防治潜在分子靶标的同时，还可进一步研发基于植物挥发物或性信息素的行为引诱剂或驱避剂。

国内外学者在灭字脊虎天牛的虫情调查、种群动态和发生规律等方面已做了大量的研究[23，2628]，但是在分子生物学尤其是嗅觉方面的研究较少。先前，我们采用转录组测序、生物信息学和分子生物学等技术研究了灭字脊虎天牛的5类化感基因家族：OBPs、气味受体（odorant receptors，ORs）、味觉受体（gustatory receptors，GRs）、离子型受体（ionotropic receptors，IRs）和化学感受神经元膜蛋白（sensory neuron membrane proteins， SNMPs）[2930]。基于已测序的转录组数据，本文进一步鉴定了该天牛的CSP基因家族，并采用PCR研究了这些CSP基因的组织表达特征;在此基础上选取触角特异表达的XquaCSP7基因进行原核表达和纯化，研究了XquaCSP7与不同寄主气味的结合特性。研究结果不仅丰富了灭字脊虎天牛的化感基因家族，还可为后续该种害虫基于寄主挥发物的行为调控剂的研发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验昆虫

灭字脊虎天牛采自云南省德宏热带农业科学研究所咖啡种植园，纬度24°1′32″N，经度97°51′18″E，海拔767 m。田间采集受害的咖啡树干，带回室内后将其用纱网套住，每天不定时观察，将羽化当天的灭字脊虎天牛雌雄成虫分开饲养，并提供咖啡枝叶和蜂蜜水作为食物。然后，分别收集3～5日龄成虫触角、头（去除触角）、胸、腹、足、翅等组织。将雌雄成虫同一组织按1∶1的比例混合，以便后续RT-PCR试验中同一组织雌雄虫cDNA模板浓度相等。收集好的组织立即用液氮速冻，保存于-80℃冰箱。

1.1.2 试验试剂

TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司;反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit、DNA rTaq酶、dNTP Mixture、10×PCR Buffer （Mg2+）和6×Loading buffer购自TaKaRa宝生物工程有限公司;SuperRed/GelRed核酸染料购自BioSharp公司。

1.2 基因的鉴定

基于已发表的灭字脊虎天牛触角转录组（SRA登录号：SRP143591），采用BLAST同源搜索的方法鉴定灭字脊虎天牛的CSP基因。首先，从NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库中下载松褐天牛、星天牛、光肩星天牛、赤拟谷盗、大猿叶虫Colaphellus bowringi的CSP作为目标序列，在BioEdit中采用本地BLAST鉴定候选的CSP基因。然后，将鉴定的所有CSP基因再次在NCBI nr蛋白序列（NCBI non-redundant protein sequence database）数据库中进行比对，确定候选的CSP基因。最后，根据鞘翅目昆虫CSP氨基酸序列中4个保守Cys及其位置（C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4），进一步确定候选的CSP基因[8，16，3132]。

1.3 序列分析

利用NCBI上的open reading frame finder（ORF finder）预测开放阅读框（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）。利用在线软件SingalP 4.1 Sever（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SingalP）预测信号肽[33]。CSP氨基酸序列间的一致性采用GeneDoc进行计算;序列比对采用Clustal X 1.83。在进化树分析中，选取了天牛科昆虫松褐天牛、云斑天牛、光肩星天牛和星天牛共42条CSP序列，利用MEGA 7.0软件邻位相连法（neighbour-joining）构建进化树，对结果进行1 000次bootstrap验证[34]。

1.4 基因的表达谱分析

根据TRIzol试剂盒使用说明书，分别提取灭字脊虎天牛各组织总RNA;然后，采用NanoDrop 1000测定其浓度。利用DNase Ⅰ去除各组织中的基因组DNA，之后采用反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit合成cDNA。选取灭字脊虎天牛肌动蛋白actin基因作为内参基因[32]，以檢测各组织cDNA模板质量及完整性。采用RT-PCR研究CSP基因在以上各组织的表达情况。PCR引物采用Primer Premier 5软件设计，引物序列送昆明奥基生物科技有限公司进行合成（表1）。PCR反应条件为：94℃预变性3 min;94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环;72℃延伸5 min。PCR扩增产物用1.2%的琼脂糖胶进行电泳分析，最后根据目的条带的有无及亮度判断CSP基因在不同组织中的表达情况。

1.5 重组蛋白XquaCSP7的表达和纯化

1.5.1 原核表达载体的构建

根据XquaCSP7基因的开放阅读框序列（去除信号肽）设计原核表达引物，并在正向和反向引物中分别加入Nde Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点（表1），从而将目的基因更好地连入载体pCzn1中。用相应的限制性内切酶（Nde Ⅰ和Xba Ⅰ）酶切表达载体pCzn1，然后与PCR扩增获得的XquaCSP7基因进行连接，获得重组质粒pCzn1-XquaCSP7。重组质粒阳性克隆进一步通过测序进行验证，以确定序列及插入方向的正确性。

1.5.2 重组蛋白的表达和纯化

将测序正确的重组质粒pCzn1-XquaCSP7转入大肠杆菌感受态细胞Arctic-Express中，离心后全部涂于含50 μg/mL氨苄青霉素（ampicillin，Amp+）的LB平板上，挑取单克隆接种于3 mL LB液体培养基（50 μg/mL Amp+）中，37℃，220 r/min振荡过夜。次日，按1∶100的比例接种于1 L LB液体培养基（50 μg/mL Amp+）中，37℃，220 r/min培养至菌体OD600值为0.6～0.8时，向培养液中加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）;然后，在37℃，220 r/min继续振荡培养4 h进行诱导表达。

4℃离心后弃上清;然后用磷酸盐缓冲液重悬菌体，超声波破碎后分别取上清和沉淀进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，以确定重组蛋白的可溶性。采用镍离子亲和层析柱对目的蛋白进行纯化，纯化后的目的蛋白液采用超滤管对其进行浓缩。

1.6 荧光竞争性结合测定

在荧光竞争性结合测定中，N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine，1-NPN）和所有化合物均购自Sigma Aldrich有限公司，纯度大于或等于90%（表2）。以色谱级甲醇为溶剂，分别配制浓度为10 mmol/L的荧光探针1-NPN和21种气味配基的母液，-20℃冰箱保存备用。使用时再用色谱级甲醇将探针和气味配基母液稀释为1 mmol/L的工作液。

首先，在96 Micro Well TM微孔板（Nunclon TM）加入2 μmol/L的蛋白和2 μmol/L的1-NPN，判断XquaCSP7与探针是否能够结合;然后，在2 μmol/L蛋白液中加入终浓度为2、4、6、8、12、16 μmol/L和20 μmol/L的1-NPN，计算XquaCSP7与1-NPN的结合常数（Kd）;最后，在2 μmol/L蛋白和2 μmol/L 1-NPN的混合液中分别加入不同浓度的气味配基，用多功能酶标仪（VARIOSKAN FLASH）进行结合测定。测定参数为：激发波长为337 nm，发射波长为370～550 nm，激发和发射狭缝均为5 nm。

2 结果与分析

2.1 灭字脊虎天牛CSP基因的鉴定

利用BLAST同源性搜索的方法，从灭字脊虎天牛触角转录组中共鉴定到14个CSP基因。所有CSP基因均具有完整的开放阅读框，编码101～148个氨基酸，且在N端均具有信号肽序列（16～26个氨基酸）。NCBI BLAST比对结果表明，所有CSP均比对到鞘翅目其他昆虫的CSP，其中XquaCSP6与松褐天牛的MaltCSP2具有最高的氨基酸一致性，为87%;而XquaCSP14与中欧山松大小蠹的DponCSP1的氨基酸一致性最低，仅为50%（表3）。

2.2 灭字脊虎天牛CSP的序列及进化分析

利用Clustal X 1.83对灭字脊虎天牛14个CSP的氨基酸序列进行比对，结果表明所有CSP均具有4个保守的Cys，模式为C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4（图1）。

为了明确灭字脊虎天牛14个CSP与鞘翅目其他昆虫CSP的进化关系，我们构建了星天牛、光肩星天牛、云斑天牛、松褐天牛和灭字脊虎天牛CSP的进化树。结果表明，除XquaCSP8和XquaCSP12聚类到同一个小分支外，其余XquaCSPs聚类到不同的分支（图2）。

2.3 灭字脊虎天牛CSP基因的表达谱分析

为了明确CSP基因的可能功能，利用RT-PCR技术研究了14个CSP基因在触角、头（去除触角）、胸、腹、足和翅等组织的表达情况。结果表明，除XquaCSP13基因外，其他XquaCSPs基因在触角中均有表达。其中XquaCSP7基因在触角特异表达;XquaCSP4、CSP5、CSP12和CSP14基因在触角高表达;XquaCSP13基因在足特异表达;其余XquaCSPs基因在除触角以外的多个组织中有表达（图3）。

2.4 灭字脊虎天牛XquaCSP7的表达及纯化

首先，检测了重组蛋白pCzn1-XquaCSP7在大肠杆菌的可溶性表达形式，超声波破碎后分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析。结果表明，pCzn1-XquaCSP7主要以包涵体的形式存在，因此采用包涵体变性和复性的方法进行纯化。将处理好的蛋白混合液过柱，纯化后得到约14 kDa的高纯度单一目的蛋白（图4）。

2.5 灭字脊虎天牛XquaCSP7与不同配基的结合能力测定

采用荧光竞争性结合测定方法，研究了XquaCSP7与21种寄主气味的结合能力。首先，测定了XquaCSP7与1-NPN的结合能力。结果表明，该蛋白与1-NPN探针具有好的结合能力，結合常数Kd为6.50 μmol/L（图5）。结合测定结果表明，XquaCSP7与21种气味配基的结合能力均较弱，1-NPN的荧光取代率在4.5%～13.5%之间。在测试的所有化合物中，XquaCSP7与苯乙酮的结合能力最强，荧光取代率为13.5%;XquaCSP7与顺-3-己烯乙酸酯的结合能力最弱，荧光取代率仅为4.5%（图6）。

3 讨论

灭字脊虎天牛是小粒咖啡上为害较为严重的蛀干害虫之一，嗅觉在其寄主定位中起着重要作用。与其他大部分昆虫的触角功能类似，天牛的触角能够感受同种性信息素和普通植物气味，在其种群繁衍和生存中必不可少[3537]。近年，转录组测序已成为基因鉴定的主要手段，基于触角转录组可鉴定到嗅觉相关的基因及害虫防治的潜在分子靶标，然后采用反向化学生态学技术可筛选到用于害虫防治的行为调控剂。从灭字脊虎天牛的触角转录组中我们已鉴定了该种害虫的5类化感基因家族：ORs、GRs、IRs、SNMPs和OBPs，并研究了它们各自的进化关系及组织表达特征[2930]。为了进一步完善该天牛的化感基因家族，本文研究了参与嗅觉感受的另一类重要化感蛋白基因：CSPs。研究结果极大地丰富了灭字脊虎天牛的化感基因家族，并为后续化感基因的功能研究奠定基础。

从灭字脊虎天牛的触角转录组中，一共鉴定到14个CSP基因，其数量多于铜绿异丽金龟Anomala corpulenta（5个）[37]、云杉八齿小蠹Ips typographus（6个）[31]、红脂大小蠹（6个）[12]、华山松大小蠹（9个）[24]、中欧山松大小蠹Dendroctonus ponderosae（11个）[31]、大猿叶虫（12个）[38]、松褐天牛（12个）[13]、光肩星天牛（12个）[14]和红棕象甲Rhynchophorus ferrugineus（12个）[39]，考虑到以上鞘翅目昆虫的CSP基因均来自于成虫触角转录组，因此推测灭字脊虎天牛有更多的CSP基因参与嗅觉感受;此外，也有可能是由于不同昆虫触角转录组测序深度和组装技术的差异导致。但是少于星天牛（16个）[15]和赤拟谷盗（20个）[16]，其中与赤拟谷盗CSP基因的数量差异较大，原因很可能是赤拟谷盗的CSP基因来源于基因组，而灭字脊虎天牛的CSP基因仅从触角转录组中获得，在其他组织特异或高表达的CSP基因并未被鉴定。

在灭字脊虎天牛中，所有CSP均具有4个保守的Cys，其保守模式“C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4”与鞘翅目其他昆虫的CSP类似[8，16，3131]，这种保守的Cys模式极大地帮助了鞘翅目昆虫CSP基因的鉴定。此外，研究发现不同物种同源的CSP间氨基酸一致性较高，如云南切梢小蠹Tomicus yunnanensis的CSP与鞘翅目其他昆虫的CSP一致性大于45%[32];星天牛[15]和光肩星天牛[14]的CSP与鞘翅目其他昆虫的CSP一致性均大于50%;类似的结果在灭字脊虎天牛中也有发现。然而，同一物种不同CSP间氨基酸一致性差异较大，如光肩星天牛CSP间的一致性为8.9%～71.8%[14];家蚕CSP间的一致性为20%～60%[17]。与其他昆虫的CSP类似，灭字脊虎天牛的14个CSP间氨基酸一致性变化较大（12%～73%），其中XquaCSP8和XquaCSP12一致性最高，在进化树中聚类到同一个小分支，且它们具有相似的组织表达特征，说明它们很可能具有相似的功能。

昆虫的CSP基因具有多样性的组织表达特征，说明其在嗅觉和非嗅觉感受中均具有重要功能。在鞘翅目中，光肩星天牛的CSP基因在触角、足、下颚须、下唇须等组织中均有表达[14]，类似的结果在星天牛[15]、铜绿异丽金龟[37]、赤拟谷盗[16]、黄曲条跳甲Phyllotreta striolata[40]、榆紫叶甲Ambrostoma quadriimpressum[41]等昆虫中也有发现。在灭字脊虎天牛中，除XquaCSP7和XquaCSP13基因外，其余XquaCSPs基因在除触角以外的多个组织中有表达，说明这些CSP基因具有多种功能。其中，XquaCSP7基因呈现触角特异表达的特点，很可能参与性信息素或是寄主气味的感受;XquaCSP13基因在足特异表达，与光肩星天牛[14]和赤拟谷盗[16]的部分CSP基因表达特征类似。在美洲大蠊Periplaneta americana中，PameCSP10（p10）基因在再生足中表达，很可能与足的再生有关[42]，灭字脊虎天牛的XquaCSP13基因是否与足的发育有关仍需进一步的功能验证。在功能研究中，选取触角特异表达的XquaCSP7基因，主要考虑到触角是灭字脊虎天牛主要的嗅觉器官，在其寄主定位中具有重要作用。此外，在结合测定中主要选取了寄主植物的气味。虽然XquaCSP7能够很好地与荧光探针1-NPN结合（Kd=6.50 μmol/L），但是在测试的21种气味物质中，XquaCSP7与所有气味配基的结合能力均较弱，没有一种配基的相对荧光值下降到50%以下。据此分析认为XquaCSP7可能是一个非广谱的结合蛋白，即结合谱较窄，仅对一种或几种气味具有结合能力;而在结合测定中，由于测试的配基数量有限，因此没能够筛选到XquaCSP7亲和力较好的配基。

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（責任编辑：田 喆）

收稿日期： 20190313   修订日期： 20190425

基金项目：云南省科技厅青年项目（2017FD101）

致  谢： 参加本试验部分工作的还有江代礼、谭翰杰、张能和纪烨斌等同学，特此一并致谢。

通信作者 E-mail：naiyong_2013@163.com

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