七氟烷与丙泊酚对老年大鼠认知功能的影响及机制*

郑仲磊， 范晓英， 杜克信

(西安医学院第二附属医院 手麻科，陕西 西安 710038)

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是麻醉手术后常见的一种中枢神经系统并发症，主要表现为记忆和学习能力下降、意识及判断出现障碍、注意力不能集中等认知功能的改变，可持续几周甚至几个月[1-2]。老年患者手术后经常会出现POCD，这不仅影响了老年患者的生活质量及医疗负担，严重时还会导致其他术后并发症的发生及人格的改变[3]。随着医疗技术的发展和老年人口的不断增加，老年患者接受手术治疗的机会增大，POCD的发病率也逐渐增加[3-4]。有研究报道，年龄>60岁的患者在接受非心脏手术后，>25%的患者在一周内会发生POCD[5]；而年龄>60岁的患者在接受腹部手术后，则大约有38%的患者也会发生POCD[6]。诱发POCD发生的因素有高龄、手术创伤及自身存在疾病等多种因素，而手术中麻醉药物的使用也是诱发POCD发生的一种诱发因素[7]。研究发现，麻醉和手术可诱发的炎症、氧化应激，可产生神经毒性，最终损伤海马组织[8]。而海马在脑中是学习和记忆等功能的重要脑区，海马损伤后则会出现学习和认知等方面的障碍[9]。七氟烷和丙泊酚是临床上应用较为广泛的全麻药物，七氟烷在临床上是用于诱导和持续性的吸入型麻醉药物，而丙泊酚则是静脉麻醉药物[10]，七氟烷、丙泊酚均会对大鼠认知具有一定的损伤作用[11-12]，但2者对老年大鼠认知功能影响的差异及其作用机制鲜有报道。本研究以老年大鼠作为研究对象，探究七氟烷与丙泊酚对老年大鼠认知功能的影响及机制，报道如下。

1 材料及方法

1.1 实验动物及材料

30只18～20月龄的SPF级SD雄性大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量450～550 g，许可证号SCXK(京)2007-2001。荧光显微镜购自日本Nikon 公司，XR-XM101 Morris 水迷宫购自上海欣软信息科技有限公司，Fabius麻醉机购自德国-Drager公司，WB电泳仪购自美国 Bio-rad 公司，H-7500型透射电子显微镜购自日本 Hitachi 公司；酶联免疫吸附 (ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，TUNEL试剂盒购自美国Chondrex公司， Caspase-3、Bax、Bcl-2、p-NF-κB及IκB抗体购自Cell Signaling Technology，免疫组织化学试剂盒购自北京博奥龙免疫技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1造模与分组 将购买的30只SD雄性大鼠在温度(22±2)℃、湿度(50±10)%、照明时间12 h昼夜交替节律的环境下适应性喂养1周，给予自由饮水和饮食。适应性喂养1周后，将SD大鼠随机分成对照组、七氟烷组及丙泊酚组，每组10只。在麻醉过程中，将3组大鼠置于特制的麻醉箱中，通过Fabius麻醉机使箱内的空气气流保持一致且流速为2 L/min，使其保持自主呼吸；七氟烷组大鼠使用麻醉机进行吸入麻醉和吸氧，调节七氟烷的浓度为3%，每天持续2 h、持续5 d；丙泊酚组大鼠给予腹腔注射50 mg/kg丙泊酚，每天1次、持续5 d；对照组大鼠置于麻醉箱中，给予正常通气处理。

1.2.2Morris水迷宫实验 Morris水迷宫是一个水深50 cm、直径120 cm的圆形水池；在实验开始前3 d，让每组大鼠在水迷宫中适应环境，并进行适当的训练。于开始造模后的第7～14天进行Morris水迷宫实验，把水迷宫划分为东南西北4个象限，平台在四象限，将大鼠面向池壁分别于水迷宫的4个象限的中部入水，使用视频追踪技术记录大鼠在水迷宫中登上平台所需的时间，记录大鼠在4个象限中登上平台所需的时间，取其平均值，作为大鼠的逃避潜伏期；若大鼠在120 s内未登上平台，则人为引导登上平台，并使其在平台上休息20 s，大鼠的逃避潜伏期记为120 s。实验的最后1 d，撤去平台，记录大鼠120 s内穿越原平台位置的次数；通过逃避潜伏期和穿过平台次数对大鼠的认知功能进行评估。在整个测试过程中，保持环境一致以排除外在环境干扰。

1.2.3大鼠海马组织标本 Morris水迷宫实验结束后，立即麻醉后处死大鼠，分离大鼠脑组织中的海马组织，分成若干份，分别用于后续实验的研究。

1.2.4细胞因子含量 采用ELISA法检测，取1份大鼠海马组织，制备成10%的组织匀浆，4 ℃、3 000 r/min离心分离得到上清液，BCA蛋白定量，按照ELISA试剂盒说明书步骤检测海马组织中肿瘤坏死因子-α(TNF)及白细胞介素-6 (IL-6)含量。

1.2.5海马组织CA1区组织形态学 采用HE染色法检测，取1份各组大鼠海马组织(每组6只)，使用10%甲醛溶液固定，组织包埋成蜡块，蜡块切片后用二甲苯进行脱蜡，100%酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精进行梯度水化，每个水化过程3 min，然后自来水缓慢冲洗30 s，苏木素染色5 min，自来水洗去组织表面多余的苏木素，1%盐酸乙醇分色，自来水冲洗3 min，0.5%伊红染色30 s，自来水冲洗1 min，95%、100%的酒精梯度脱水2 min，用二甲苯对切片透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

1.2.6海马组织神经元形态学 采用透射电镜观察，取1份各组大鼠新鲜的大鼠海马组织(每组6只)，甲醛固定，固定完成后，洗去表面甲醛溶液，放入1%锇酸中反应60 min，PBS缓慢清洗3次，在梯度酒精中进行脱水，用环氧树脂在37 ℃条件下对组织进行包埋，切片，使用3%醋酸铀-构椽酸铅染色剂使其染色，透射电镜下观察海马神经元超微结构。

1.2.7海马组织Bax及p-NF-κB蛋白的表达 采用免疫荧光法检测，取出1.2.5包埋好的组织块，烘片、脱蜡、抗原修复，PBS缓慢清洗、3 min/次，3%H2O2灭活内源性过氧化氢酶，PBS缓慢清洗，3 min/次，5% BSA 封闭30 min，孵一抗(Bax和p-NF-κB)4 ℃中过夜，复温，PBS缓慢清洗，3 min/次，孵育荧光二抗2 h，PBS缓慢清洗，3 min/次，DAB显色，苏木素复染，脱水和二甲苯透明，封片，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.8海马CA1区细胞凋亡检测 采用TUNEL染色法，取1.2.5包埋好的组织切片，烘片1 h，切片在二甲苯和梯度酒精中脱蜡，滴加20 mg/L的蛋白酶工作液，37 ℃烘箱中15 min，滴加TUNEL反应液，37 ℃烘箱中避光孵育1 h，PBS缓慢清洗3次、3 min/次；滴加DAPI孵育10 min，PBS缓慢清洗3次、3 min/次，封片，荧光显微镜下观察拍片。

1.2.9海马组织Caspase-3、Bax、Bcl-2、p-NF-κB和IκB蛋白表达 采用Western blot法检测，取1份新鲜的大鼠海马组织，加入裂解液后提取脑海马组织总蛋白，BCA 蛋白定量法检测裂解液中总蛋白浓度。按照样本与上样缓冲液4 ∶1的比例加入上样缓冲液，在沸水中使蛋白变性10 min，获得电泳蛋白样本。采用SDS-PAGE电泳法，转膜，封闭，完成封闭后，TPBS清洗3次，PBS清洗1次、8 min/次；孵一抗(Caspase-3、Bax、Bcl-2、p-NF-κB和IκB，1 ∶100)4 ℃下孵育过夜，TPBS 清洗3次；孵二抗 (1 ∶30 000)，TPBS清洗3次，PBS 洗1次、8min/次，洗膜完成后，配置显影液，把显影液涂抹在PVDF膜上，使用凝胶成像系统扫描目的蛋白，Image-Pro Plus软件分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 Morris水迷宫实验结果

Morris水迷宫结果显示，3组大鼠逃避潜伏期比较，七氟烷组>丙泊酚组>对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；3组大鼠穿越平台次数七氟烷组<丙泊酚组<对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 大鼠认知功能实验指标(n=10)Tab.1 The experimental index of cognitive function in rats(n=10)

注：(1)与对照组比较，P<0.05；(2)与丙泊酚组比较，P<0.05。

2.2 海马组织TNF-α及IL-6含量

ELISA法检测结果显示，3组大鼠海马组织TNF-α及IL-6含量比较，七氟烷组>丙泊酚组>对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 海马CA1区组织学及海马神经元形态

HE染色结果显示，对照组大鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐致密，细胞大小、形态正常，核仁、细胞质清晰；七氟烷组神经元明显减少，锥体神经

表2 大鼠脑海马组织中细胞因子含量(n=10)Tab.2 The cytokine levels in the hippocampus of rat brain(n=10)

注：(1)与对照组比较，P<0.05；(2)与丙泊酚组比较，P<0.05。

元排列松散、不规则，部分神经元表现为核固缩和胞质过浓；丙泊酚组中病理与七氟烷组相比，形态学改变相对较轻。透射电镜结果显示，对照组大鼠海马神经元细胞核结构完整，排列规则；七氟烷组海马元神经的细胞核发生明显变化，细胞核膜开始内陷，结构不完整；丙泊酚组细胞核轻度内陷，呈半月板状。见图1。

图1 各组大鼠海马组织及神经元形态学变化Fig.1 The morphological changes of hippocampus and neurons in rats

2.4 Bax及p-NF-κB蛋白表达

免疫荧光结果显示， 3组大鼠海马组织Bax及p-NF-κB蛋白表达水平比较，七氟烷组>丙泊酚组>对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.5 海马组织细胞凋亡

结果显示，TUNEL染色中阳性的细胞核为绿色，DAPI染色的细胞核为蓝色；3组大鼠海马组织凋亡指数比较，七氟烷组>丙泊酚组>对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.6 Caspase-3、Bax、Bcl-2、p-NF-κB及IκB蛋白表达

如图4所示，3组大鼠海马组织中Caspase-3、Bax和p-NF-κB蛋白表达水平计较，七氟烷组>丙泊酚组>对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；3组大鼠海马组织中Bcl-2和IκB蛋白表达水平计较，七氟烷组<丙泊酚组<对照组，，差异有统计学意义(P<0.05)。提示，七氟烷和丙泊酚引起的认知功能障碍可能与NF-κB和Bax/Caspase-3信号通路有关。

注：(1)与对照组比较，P<0.05；(2)与丙泊酚组比较，P<0.05。

图2 各组大鼠脑海马组织Bax及p-NF-κB蛋白表达(免疫荧光法，×400)
Fig.2 Immunofluorescence detection of the expression of Bax and p-NF-κB in the hippocampus of rats (immunofluorescence,×400)

注：(1)与对照组比较，P<0.05；(2)与丙泊酚组比较，P<0.05。

图3 各组大鼠脑海马组织细胞凋亡水平(TUNEL，×400)
Fig.3 TUNEL analysis of the apoptosis level in the hippocampus of rats (TUNEL,×400)

注：(1)与对照组比较，P<0.05；(2)与丙泊酚组比较，P<0.05。

图4 各组大鼠脑海马组织中Caspase-3、Bax、Bcl-2、p-NF-κB及IκB蛋白表达(Western blot)
Fig.4 Expression of Caspase-3, Bax, Bcl-2, p-NF-κB and IκB in the hippocampus of rats(Western blot)

3 讨论

POCD是指在外科手术后引起的一系列中枢神经系统的障碍，表现出失语、失行、失认等改变，严重者甚至可进一步发展为失智[13-14]。脑部是麻醉药的靶器官，中枢神经系统功能在接受麻醉后会受到抑制，这表明POCD的危险因素可能是麻醉引起的[15]。七氟烷和丙泊酚在临床上被广泛应用于麻醉手术中，前者为吸入型麻醉药，后者静脉注射型麻醉药，有研究表明，七氟烷和丙泊酚对大鼠神经系统具有损伤作用[16-17]，但2者差异及其作用机制鲜有研究。本研究通过HE染色和电镜扫描检测老年大鼠脑组织病理变化，结果显示，与正常组相比，七氟烷组和丙泊酚组大鼠脑组织都受到不同程度的病理损伤，但是七氟烷组损伤更加明显。Morris水迷宫实验是典型的行为学实验，它可以反映动物空间学习记忆的能力，在本次研究中，七氟烷组和丙泊酚组大鼠潜伏期显著高于对照组，穿过平台次数少于对照组，且七氟烷组大鼠潜伏期明显高于丙泊酚组，穿过平台次数少于丙泊酚组，由此说明七氟烷麻醉后对老年大鼠认知功能的损害更加明显。

老年人在受到应激、创伤、麻醉等过程后发生神经元凋亡是造成认知功能障碍的重要影响因素，该环节会诱发机体产生炎症反应，激活NF-κB信号通路，促使中枢和外周释放多种炎症因子，如TNF-α和IL-6等，而这种炎症因子能够介导神经元的损伤和凋亡，从而引起中枢神经系统出现认知功能障碍[18-19]。在本研究中，NF-κB信号通路被激活，p-NF-κB蛋白表达明显增多，从炎症因子含量检测可见七氟烷组和丙泊酚组老年大鼠脑中TNF-α和IL-6显著高于对照组，且七氟烷麻醉后的大鼠脑中炎症因子含量更高，提示七氟烷和丙泊酚麻醉药都能诱发神经系统产生炎症反应，但七氟烷对神经功能损伤高于丙泊酚。

大鼠海马组织中细胞凋亡过度激活是造成神经元损伤的重要原因[20]。促凋亡蛋白 Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2是一组能够反映机体凋亡水平的蛋白，Bax能够形成同源二聚体促进线粒体中细胞色素C的释放，而Bcl-2起到抑制作用，细胞色素C的释放能够诱发级联反应，造成Caspase-3的活化，从而导致细胞凋亡[21-22]。本研究利用 Western blot和TUNEL 染色检测了大鼠海马组织神经元的凋亡水平。结果显示，与对照组相比，七氟烷组和丙泊酚组大鼠 Caspase-3和Bax蛋白表达水平明显升高，Bcl-2表达水平降低，TUNEL结果显示大鼠海马神经元凋亡明显增加。进一步提示七氟烷麻醉后，老年大鼠大脑海马组织的神经元凋亡更加严重，这也验证了七氟烷引起更严重的认知功能障碍的原因。

综上所述，七氟烷与丙泊酚均可引起老年大鼠的认知功能障碍，其机制可能与NF-κB和Bax/Caspase-3信号通路有关，但丙泊酚对认知功能影响低于七氟烷。