PARP抑制剂对胰腺癌细胞的抗肿瘤机制及耐药性分析*

王蒲雄志， 夏光慨， 卢家俊， 袁周， 史向军， 黄新余

(上海交通大学附属第六人民医院 肝胆胰外科， 上海 200233)

胰腺癌是消化道的恶性肿瘤，发病率居我国恶性肿瘤第10位[1]。胰腺癌是预后极差的恶性肿瘤之一，死亡率居我国恶性肿瘤第6位[2]。随着人们生活方式的不断改变及生活水平不断提高，胰腺癌的发病比例和死亡比例逐年增加[3]。目前对于胰腺癌患者临床多采用外科手术为主、放射性治疗和化学药物治疗为辅的综合治疗方案，能够缓解临床症状，缩小原发病灶，减缓肿瘤发展速度，但胰腺癌恶性程度极高，病情进展迅速，手术切除率低，对放化疗敏感性低，患者往往预后不良，5年生存率不足5%，严重威胁人类健康[4-6]。因此，寻找有效的治疗方法对提升胰腺癌患者的预后尤为重要。聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)是一种重要的DNA修复酶，广泛存在于真核生物细胞核中，具有维持基因组稳定、参与DNA复制、转录及修复、保持染色体结构完整性的作用，在细胞生物学行为、恶性肿瘤发生及进展过程中发挥关键的作用[7-8]。随着肿瘤分子生物学的不断发展，分子靶向治疗逐渐应用于临床肿瘤治疗[9]。PARP抑制剂是一种新型分子靶向药物，能够影响癌细胞的自我复制，在胃癌[10]、乳腺癌[11]、卵巢癌[12]等恶性肿瘤的靶向治疗中有较好的应用，但其在胰腺癌中的应用较为少见。本研究以人胰腺癌顺铂耐药细胞株PATU-8988/DDP细胞作为研究对象，采用PARP抑制剂AG014699及顺铂处理细胞，观察处理后细胞的增殖及凋亡的变化，同时检测细胞中 PARP蛋白表达水平，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞 人胰腺癌顺铂耐药细胞株PATU-8988/DDP，购于上海美轩生物科技有限公司。

1.1.2实验分组及处理 将PATU-8988/DDP细胞分为对照组、PARP抑制组及联合顺铂组，进行原代培养，待细胞融合度达85%时，细胞消化、传代，取对数生长期的PATU-8988/DDP细胞，以5×106个/孔接种于6孔细胞培养板中，用含10%胎牛血清(上海源叶生物科技有限公司)的DMEM培养基(上海觅拓生物科技有限公司)，于37 ℃、5% CO2培养箱(常州普天仪器制造有限公司)培养，待细胞融合度达90%时，对照组加入DMEM培养液培养24 h，PARP抑制组加入10 μmmol/L PARP抑制剂AG014699(上海联迈生物工程有限公司)培养24 h，联合顺铂组加入10 μmmol/L PARP抑制剂AG014699及10 mg/L顺铂(南京赛泓瑞生物科技有限公司)培养24 h。

1.2 方法

1.2.1PATU-8988/DDP细胞增殖率检测 采用MTT法，取1.1.2项下的各组PATU-8988/DDP细胞，吸掉培养液，每孔加入MTT溶液(武汉益普生物科技有限公司)20 μL，37 ℃孵育4 h，每孔加入二甲基亚砜溶液(北京金克隆生物技术有限公司)150 μL，振荡10 min，采用酶标仪(上海枫起生物科技有限公司，型号Infinite® F50)测定490 nm波长下OD值，计算细胞增值率，细胞增殖率=(处理组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.2PATU-8988/DDP细胞凋亡率检测 采用流式细胞术，取1.1.2项下的各组PATU-8988/DDP细胞，吸掉培养液，用1 ×Tris Buffer缓冲液(武汉华联科生物技术有限公司)洗涤，0.25%胰蛋白酶(上海圻明生物科技有限公司)消化，制备细胞悬液，向流式管中依次加入细胞悬液300 μL、PI染液(上海赫果生物科技有限公司)5 μL、Annexin V-FITC(北京博迈斯科技发展有限公司)5 μL，避光反应15 min，采用流式细胞仪(上海迪奥生物科技有限公司，型号CyFlow® Cube 6)检测各组PATU-8988/DDP细胞凋亡率。

1.2.3PATU-8988/DDP细胞中 PARP蛋白表达 采用Western blot法，取1.1.2项下的各组PATU-8988/DDP细胞，加入细胞裂解液(上海子起生物科技有限公司)，充分裂解，采用离心机(广州菲罗门科学仪器有限公司，型号SelectspinTM17R)，13 000 r/min离心15 min，取上清液，使用BCA试剂盒(北京泽平科技有限责任公司)测定白浓度并对蛋白定量，取总蛋白上样于10% SDS-PAGE胶、电泳、切胶、转膜，5%脱脂奶粉封闭液(上海君瑞生物技术有限公司)封闭、加入1 ∶200稀释的 PARP单克隆抗体一抗(上海钰博生物科技有限公司)、1 ∶400稀释的β-actin单克隆抗体一抗(南京善本生物科技有限公司)，4 ℃孵育过夜，PBS溶液(上海春晓生物技术有限公司)漂洗，加山羊抗兔IgG二抗(美国Invitrogen公司)，37 ℃孵育1 h，采用ECL发光试剂盒(上海传秋生物科技有限公司)显色，洗片后显影、定影，应用Image Quant TL软件(上海浩然生物技术有限公司)进行分析，选取β-actin为内参照，以 PARP灰度值与β-actin灰度值之比表示 PARP蛋白表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 PATU-8988/DDP细胞增殖率

结果显示，培养24 h时，3组细胞增殖率比较，联合顺铂组

表1 各组PATU-8988/DDP细胞增殖率Tab.1 Cell proliferation rate of PATU-8988/DDP

注：(1)与对照组比较，P<0.001；(2)与PARP抑制组比较，P<0.001。

(1)与治疗前比较，P<0.01。

2.2 PATU-8988/DDP细胞凋亡率

结果显示，培养24 h时，3组细胞增殖率比较，联合顺铂组>PARP抑制组>对照组，两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组PATU-8988/DDP细胞凋亡率Tab.2 Apoptosis rate of PATU-8988/DDP

注：(1)与对照组比较，P<0.001；(2)与PARP抑制组比较，P<0.001。

2.3 PATU-8988/DDP细胞中PARP蛋白表达

结果显示，培养24 h时，PARP抑制组及联合顺铂组PATU-8988/DDP细胞中PARP蛋白表达水平显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；联合顺铂组与PARP抑制组PATU-8988/DDP细胞中PARP蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表3。

表3 各组PATU-8988/DDP细胞中PARP蛋白表达水平Tab.3 Levels of PARP protein expression of PATU-8988/DDP cells in each

组别PARP蛋白表达水平对照组2.87±1.23PARP抑制组1.11±0.49(1)联合顺铂组1.09±0.47(1) F9.520 P0.002

注：(1)与对照组比较，P<0.001。

3 讨论

胰腺癌病因尚不明确，目前认为与环境污染、吸烟、饮酒、过量饮用咖啡、高脂肪饮食、高蛋白饮食及遗传因素有关，已经成为严重威胁人类健康的主要公共卫生问题之一[13]。外科手术是目前治疗胰腺癌的主要方法，但胰腺癌初期症状不具备特异性，早期诊断困难，60%～80%患者因上腹部饱胀不适、恶心、呕吐、腹泻、消瘦、疼痛而就诊时多已处于中晚期，已不能行外科手术治疗[14-15]。且胰腺为人体重要腺体之一，解剖关系隐匿且复杂，手术不能彻底切除，癌细胞可向腹腔内种植，还可沿切口面、缝线处转移，术后复发率高[16-17]。放射性治疗和化学药物治疗是目前治疗胰腺癌的辅助方法，能够清除原发病灶，阻止肿瘤进展，但具有不良反应多、易产生耐药性等不足[18]，因此寻找有效治疗方案对降低胰腺癌病死率有着重要意义。

PARP是一种广泛存在于真核生物细胞核中的DNA修复酶，能够催化ADP-核糖单元从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转移到各种受体蛋白，维持基因组稳定，参与DNA复制、转录及修复，保持染色体结构完整性，并在细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等细胞生物学过程中发挥关键作用[19-20]。PARP也是恶性肿瘤发生、发展过程中的主要转录因子，抑制其活性可以增强DNA损伤类化疗药物及放射性治疗的治疗效果，现已成为抗肿瘤治疗的新靶点之一[21]。随着广大学者对肿瘤分子生物学的不断深入研究，分子靶向治疗逐渐应用于临床治疗各类恶性肿瘤。PARP抑制剂为DNA修复酶抑制剂，是一种新型分子靶向药物，能够通过靶向阻断癌细胞DNA修复而发挥抗癌作用[22-23]。有研究发现，沉默卵巢癌细胞中PARP表达后可抑制DNA损伤修复机制，增强化疗药物对卵巢癌细胞DNA损伤，促进卵巢癌细胞凋亡，抑制卵巢癌细胞增殖[24]。也有研究发现， PARP抑制剂能够上调微小核糖核苷酸664b-5p(Microribonucleotide 664b-5p，miR-664b-5p)表达而增加BRCA1突变三阴型乳腺癌对化疗药物的敏感性[25]。本研究的结果与上述研究相符，结果显示PARP抑制组PATU-8988/DDP细胞增殖率显著低于对照组，PARP抑制组PATU-8988/DDP细胞凋亡率显著高于对照组，提示PARP抑制剂可抑制胰腺癌细胞的增殖及促进胰腺癌细胞的凋亡。本研究还发现联合顺铂组PATU-8988/DDP细胞增殖率显著低于PARP抑制组、而细胞凋亡率显著高于PARP抑制组，提示PARP抑制剂可提高胰腺癌细胞对顺铂的敏感性，增强顺铂对胰腺癌细胞的化学毒性。本研究另一个结果还发现，PARP抑制组PATU-8988/DDP细胞中PARP蛋白表达水平显著低于对照组，而联合顺铂组PATU-8988/DDP细胞中PARP蛋白表达水平与PARP抑制组差异不大，提示PARP抑制剂可能通过下调PARP表达发挥对胰腺癌细胞的抗肿瘤作用，降低胰腺癌细胞对顺铂的耐药性，这可为PARP抑制剂的临床应用提供一定的理论基础。

综上所述，PARP抑制剂可抑制胰腺癌细胞增殖，促进胰腺癌细胞凋亡，提高胰腺癌细胞对顺铂的敏感性，增强顺铂对胰腺癌细胞的化学毒性，其机制可能与 PARP抑制剂下调PARP表达有关。但 PARP抑制剂抗胰腺癌的机制是否还有其他，有待进一步研究。