宏基因组学二代测序在不明原因发热患者病原体检测中的应用*

张 彬，张 弦，赵 华，顾宇峰，周 跃，金爱萍，谭晓慧，张海峰

（南通大学附属医院1 感染性疾病科；2 影像中心，江苏226001）

不明原因发热（FUO）鉴别诊断一直是困扰临床医生，尤其是感染性疾病科医生的问题，其病因常见三大类:感染、风湿免疫性疾病、恶性肿瘤等[1]。有时会因机体免疫反应失控导致类似全身炎症反应表现，重症者甚至累及多个脏器系统而发生多器官功能障碍（MODS）。临床上识别感染性发热对合理用药，尤其抗菌药物具有重要意义。本研究选择2018 年7月—2019 年10 月我院收治的51 例不明原因发热患者，观察宏基因组学二代测序（mNGS）技术在病原检测中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 不明原因发热51 例，其中男性33例，女性 18 例；年龄 15～79 岁，平均 54.57±16.73 岁；发热时间 12～35 天，平均 19.82±4.93 天。纳入标准:（1）在我院经1 周以上全面系统的发热病因筛查未能明确者；（2）非免疫力缺陷患者。系统筛查包括血、尿、大便三大常规，大便隐血试验，肝、肾功能，电解质，血糖，血、尿、痰培养，血清自身抗体、全胸片（或胸部CT）和腹部B 超等。

1.2 标本留取 根据患者临床表现以及实验室筛查结果，经医患充分沟通，患方签署针对mNGS 高额费用知情同意书及采信院外检查结果知情同意书。于停用抗菌药物12 小时以上发热时，留取可疑部位血液、尿、痰或肺泡灌洗液、骨髓、脑脊液等标本，一份送本院微生物室作细菌培养，另留一份mNGS 标本外送华大基因检测公司作病原学检测。mNGS 标本的采集、保存和运输严格按照该公司标准化规范执行。

1.3 病原学mNGS 检测

1.3.1 标本处理和DNA 提取:血液标本离心后取300 μL 血浆，痰液或肺泡灌洗液经玻璃珠混合震荡后取0.5～3 mL，脑脊液取300 μL。使用TIANamp Micro DNA Kit（DP316，TIANGEN BIOTECH，Beijing，China），根据试剂盒说明书提取DNA（用作DNA 文库构建），应用超声破碎至200～300 bp 的片段备用。

1.3.2 文库构建和测序、数据分析:使用Agilent 2100 Bioanalyzer 质控文库、Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）质控 DNA 文库，文库经环化后再滚环复制（RCA）形成DNB 纳米球，然后加载至测序芯片，应用BGISEQ-500 进行高通量mNGS 测序。测序所得原始结果中去除质量低的数据，通过所得高质量数据中比对BWA:（http://biobwa.sourceforge.net/）去除人参考基因组序列和低复杂度结果（Reads），最后参照微生物大数据库，将比对后的数据按照细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体/衣原体等分类罗列形成初步实验室报告。对于与细菌培养结果明显不符、高度怀疑的病原学mNGS 结果，采用PCR 扩增/Sanger 测序验证。

1.4 临床解读 临床医生依据患者病情、临床表现、影像学检查以及经验，全面分析细菌培养、mNGS病原检测报告，区分非无菌部位定植与感染，去除mNGS 背景病原检测假阳性结果，确定FUO 相关致病病原体。

1.5 统计学处理 使用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析处理。应用四格表计算传统微生物培养和mNGS 病原二代测序的敏感性，特异性，阳性、阴性预测值和约登指数（Youden index）；病原学mNGS 与传统培养结果比较采用配对χ2检验，两种方法诊断结果的一致性采用Kappa 检验，并统计病原微生物检出诊断效能。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床标本阳性检测结果 血、骨髓、脑脊液、痰液、肺泡灌洗液等标本病原mNGS 检出的病原体数量和种类明显多于传统培养，见表1。传统培养和mNGS 检测将1 例4573746 患者诊断为白假丝酵母菌和嗜麦芽窄食单孢菌混合感染；1 例4493789 患者mNGS 检测发现烟曲霉、尖端赛多孢子菌，但培养仅烟曲霉阳性；另2 例患者培养示肺炎克雷伯菌，但其中1 例3871916 患者mNGS 检测发现除肺炎克雷伯菌，尚有产黄青霉，另1 例4033977 患者还发现嗜麦芽窄食单孢菌感染；1 例4412395 患者培养出白假丝酵母菌，而mNGS 未检测到；1 例患者痰标本培养示鲍曼不动杆菌，但病原mNGS 另外还检测到人类腺病毒7 型。值得一提的是，传统方法无法培养病毒，而病原mNGS 在20 例患者标本中检测出6 种病毒:乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1 型、人类疱疹病毒7 型、巨细胞病毒、EB 病毒和人类腺病毒7 型。1例患者标本中检测到鹦鹉热支原体。

2.2 病原mNGS 与传统培养检测阳性率及一致性 表1 按病原体分类列出传统培养和病原mNGS检测结果，传统培养共检出细菌8 例（结核分枝杆菌1 例），真菌 4 例；相比之下，病原 mNGS 在 30 份标本中鉴定出60 个病原体，其中细菌22 例（结核分枝杆菌4 例）、真菌12 例。结合传统培养和病原mNGS检测，在30 例标本中鉴定出25 种病原体。依据临床表现、血常规、PCT、hCRP、前期经验性治疗效果，最终判定病原mNGS 结果，见表2。病原mNGS 检测阳性率41.18%（21/51），高于传统培养阳性率23.53%（12/51），差异有统计学意义（P=0.012）。Kappa 一致性检验表明，病原mNGS 与传统培养诊断结果存在一般一致性（Kappa=0.524，P＜0.001）。

表1 mNGS 与传统培养检测病原体阳性结果比较 例

表2 病原学mNGS 与传统培养检测细菌、真菌阳性结果比较

2.3 桑格（Sanger）一代测序验证 在本研究中当传统培养与病原mNGS 结果不符，尤其是后者阳性病原体多于2 种时，应用桑格一代测序行病原体验证测试，结合临床表现、原有经验性治疗疗效判定致病病原体，结果显示病原mNGS 与Sanger 验证病原体检测一致性为100%。

2.4 两种方法的诊断效能 如果沿用传统培养作为诊断细菌（结核分枝杆菌）、真菌感染金标准，根据表2，病原mNGS 检测细菌、真菌的灵敏度，特异性，阳性预测值，阴性预测值和约登指数分别为91.67%，74.36%、52.38%、96.67%、0.6603。如果将mNGS 检测到的病毒、支原体计算在内，检测阳性率从传统培养的 23.53%（12/51）增至 60.78%（31/51）。提示病原mNGS 技术在同时检测细菌、真菌、病毒和支原体等不易培养的病原体方面具有明显优势。

3 讨 论

不明原因发热（FUO）病因鉴别非常重要，只有筛查出非感染性发热者，才能减少不必要的抗菌药物暴露和治疗费用，对临床合理使用抗菌药物具有积极意义[2]。传统检测感染病原体主要依靠血液、体液、组织等培养以及分子生物学诊断技术，微生物培养目前仍是感染病原诊断的金标准，但临床上并非所有病原体都可通过传统培养方法识别。此外，传统培养方法存在耗时长、不同病原体需不同培养基、阳性率过低等缺陷。分子生物学诊断方法，如酶联免疫吸附（ELISA）原位杂交、聚合酶链式反应（PCR）、一代桑格测序以及MALDI-TOF MS 均依赖于病原体核酸的已知序列[3]，ELISA 基于抗原-抗体反应，这些检测方法每次检测仅识别有限甚至特定的病原体种类。

近年来寻找更理想的感染病原学检测方法成为研究热点。高通量mNGS 既往在遗传性疾病、肝炎、炎症性肠病和恶性肿瘤等临床中获得应用[4]，随着该技术更快的检测周期和费用降低而用于病原微生物的筛查。与传统培养相比，病原mNGS 检测几乎达到“一网打尽”效果，能同时敏感识别不同类病原体，尤其在细菌感染合并真菌、病毒、支原体、衣原体或原虫等感染时更具显著意义。本研究结果显示，当同一患者需同时排查所有病原体时，mNGS 检测可使阳性率从传统培养的23.53%（12/51）增高至60.78%（31/51）；与传统培养比较，mNGS 检测阳性病原体增加了 8 种细菌、3 种真菌、6 种 DNA 病毒、1 种支原体。两种方法的细菌、真菌诊断结果存在明显差异，发现10 例标本传统培养为阴性，但mNGS 检测为阳性，结合临床表现、经验性治疗疗效等判定为感染者。其原因可能在留取标本前怀疑细菌、真菌感染，已经验性使用抗菌药物，导致病原微生物不易培养，而mNGS 可检出更微量的病原体核酸，具有更广的微生物谱。传统培养仅能检测到一种优势病原体，而其他合并感染的病原体可能被抑制而无法检出，而mNGS 更高的敏感性使得病原体检出更全面。如本研究中4493789 患者传统培养仅检出烟曲霉，而mNGS 还同时发现烟曲霉和尖端赛多孢子菌；另2例患者培养示肺炎克雷伯菌，但mNGS 发现其中3871916 患者尚合并产黄青霉，4033977 患者合并嗜麦芽窄食单孢菌感染。

文献[5-7]报道及本研究结果均提示mNGS 对病原体检测较传统培养敏感性更高，可以帮助感染患者明确诊断。细菌、病毒等感染患者可表现相似的临床症状，针对病因进行正确干预，对指导抗菌药物合理使用具有积极作用。当然，mNGS 的高敏感性也会带来一些麻烦。本研究中少部分患者，尤其是危重症或糖尿病患者，mNGS 从同一标本中检出细菌、真菌、病毒等多种病原体，这需要经验丰富的临床医生在区分定植致病病原微生物后，依据读取病原体条带数，结合患者临床表现、经验性治疗效果、血常规、PCT、CRP 等检查结果，确定可能的病原体。同时需注意不同来源标本阳性结果的价值有差异，与体外相通体腔留取的标本，如痰液标本阳性，尤其存在多部位感染时，需区分定植与感染，而无菌体液如脑脊液、血液标本则不存在这类困扰。

感染病原mNGS 检测存在不足之处，除可能出现的假阳性外，仪器设备昂贵、检测技术要求高等原因使其难以在各家医院普及[8]，多数医院需与检测公司合作，外送标本定点检测。mNGS 测试周期虽然比传统培养短，一般在72 小时内出具报告，但这对于重症感染患者来说时间过长，直接影响患者精准治疗与预后。目前mNGS 检测费用高，难以成为感染性病原常规诊断方法。mNGS 已成功用于鉴定某些病毒感染[9-10]，但目前外送标本异地集中检测，途中RNA 易降解，致RNA 病毒检出率较低。随着公司布点增多、技术进步，缩短检测周期和降低检测费用，有望病原mNGS 检测在临床上广泛开展，更好地服务发热患者。