铁皮石斛发酵酒品质特性研究

任运红，徐雅囡，钟淳菲，杨子银，杜 冰*

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642；2.中国科学院华南植物园，广东广州 510650）

铁皮石斛（Dendrobium candidum）为兰科石斛属植物铁皮石斛的干燥茎，因表皮呈铁绿色而得名[1]。铁皮石斛含有大量的多糖、生物碱、氨基酸、花色苷等营养成分，具有滋阴清热、益胃生津的功效，在我国药用历史悠久，可入胃经、肾经，具有抗疲劳、抗肿瘤、祛痰镇咳等独特的药用价值[2-4]。因其具有显著的保健功效且口感良好，传统上铁皮石斛在民间广泛被用于生食、榨汁、炖汤、泡茶、泡酒等[5-7]，而工业上通常加工成铁皮石斛功能性饮料、铁皮石斛保健品、铁皮石斛护肤品等[8-9]。但是目前大多数铁皮石斛产品还处于初级加工阶段，对其精深加工不足、新产品研发力度不够。

随着人们对中草药铁皮石斛关注度的提高，在其传统加工方法上，益生菌发酵作为一种新技术，也逐渐应用于铁皮石斛产品的加工中。王超等[10]研究发现，经鼠李糖乳杆菌发酵得到的铁皮石斛汁pH降低，有机酸含量及活菌数有所增加。薛燕等[11]采用液态发酵法发酵铁皮石斛，发现铁皮石斛多糖含量增加，抗氧化能力提高。目前，石斛酒主要采用浸泡的方式，但是经简单泡制制得的铁皮石斛酒，不能有效地溶出其中的活性成分，降低了营养成分的利用率，使得产品口感不佳，保健作用不明显，并常伴有饮后上头或酒后不适等情况[12]。本课题组曾丽萍等[13]前期优化了产乳酸芽孢杆菌（Bacillussp.）DU-106和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合发酵铁皮石斛酒工艺，本研究通过对比发酵前后铁皮石斛酒的理化性质及组成成分，进一步评价其品质特性，为铁皮石斛发酵酒的产品研发提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

铁皮石斛：红河群鑫石斛种植有限公司。

1.1.2 菌种

产乳酸芽孢杆菌（Bacillussp.）DU-106：筛选自传统发酵奶酪，现由华南农业大学新资源食品及功能性原料评价及研究中心鉴定及保存，并委托广州市微生物所制成1×1012CFU/g的菌粉，作为发酵实验备用；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）171：安琪酵母公司，为本实验室保存，菌粉浓度为108CFU/g。

1.1.3 试剂

葡萄糖、亚硝酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、无水硫酸钠、盐酸、氯化钾、氯仿、苯酚、甲醇、乙醚、乙醇：均为国产分析纯；偏磷酸（优级醇）；乙腈、甲醇（色谱纯）：天津科密欧公司；酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸：美国Sigma-Aldrich公司；甲酸（色谱纯）：上海斯信生物科技有限公司；乙腈（色谱纯）：美国Thermo Fisher公司；pH 1.0的缓冲溶液：0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25∶67（V/V）。

1.2 仪器与设备

PHs-3C精密pH计、752-N紫外分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；WYT手持糖量计：早州中友光学仪器有限公司；GC6890-5973MSD气相色谱-质谱仪、1290 Infinity液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（liquid chromatography quadrupole-time of flight mass spectrometry，LC-Q-TOF-MS）系统：美国安捷伦公司；LC-20AT高效液相色谱仪：日本岛津公司；DHP-600电热恒温培养箱：北京市永光明医疗仪器厂；BS110S精密电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；VD-650桌上式洁净式工作台：苏州净化设备有限公司；Laborata 4000旋转蒸发仪：德国Heidolph公司；Esquire HCT Plus 质谱仪：美国Waters公司。

1.3 实验方法

1.3.1 铁皮石斛酒的制备

将铁皮石斛干品去丝络、洗净后切成约1 cm的小段，沸水热烫2～3 min，沥干后按料液比1∶4（g∶mL）加入20 g/L蔗糖溶液进行调配，制得发酵体系。分别将0.1 g产乳酸芽孢杆菌菌粉和0.5 g酿酒酵母菌菌粉加入50 mL生理盐水和5 g/L蔗糖溶液中，30 ℃条件下活化30 min，然后按1∶10（V/V）的比例混合制得菌种活化液。在发酵体系中添加2%的菌种活化液，30 ℃发酵7 d，得铁皮石斛发酵酒[13]。

1.3.2 理化指标的测定

（1）pH的测定：采用pH计测定

（2）总酸含量的测定：采用pH电位法[14]测定，并进行适当修改。

（3）酒精度的测定：参照GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》中的方法进行测定[15]。

（4）可溶性固形物含量的测定：参照GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》中的方法进行测定[16]。

1.3.3 活性成分的测定

（1）多糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法[17]测定样品中的多糖含量。

（2）花色苷含量的测定：采用pH示差法[18]。

（3）铁皮石斛发酵酒红色素的测定

选择大孔树脂对铁皮石斛红色素进行纯化后进行分离鉴定，条件如下：

高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析系统：泵型Waters 600，检测器Waters 2998PAD，Waters C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），检测波长520 nm，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，检测温度30 ℃，混合洗脱剂A：0.04%甲酸-H2O，B：100%乙腈，洗脱条件：0～5 min，10%～15%B；5～10 min，15%～18%B；10～20 min，18%～20%B；20～25 min，20%～23%B；25～30 min，23%～10%B；40～45 min；保持10%B。

液相色谱-质谱联用（liquidchromatographmassspectrometer，LC-MS）分析系统：检测波长520 nm，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，检测温度30 ℃，混合洗脱剂A：0.04%甲酸-H2O，B：100%乙腈。

电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）系统：正离子模式，扫描质量范围：100～1 000 m/z，毛细管出口电压：121 V，Skim 1电压：40 V，二级质谱MS-MS 用于断裂[M+H]+离子。

1.3.4 有机酸组成及含量的测定[19]

采用高效液相色谱法测定酒中的有机酸：色谱条件为WondaSil C18-WR（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相0.2%偏磷酸，柱温35 ℃，流速0.8 mL/min，进样量20 μL，检测波长210 nm。

分别以酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸为标准品，得出各自的标准曲线回归方程为y=0.027 5x+0.081 5，R2=0.999 6、y=0.040 3x-0.011 7，R2=0.999 9、y=0.022 5x+0.008 8，R2=1、y=0.016 3x+0.001，R2=0.999 8、y=0.051x-0.0342，R2=0.999 9。样品溶液用超纯水稀释经0.22 μm微孔滤膜过滤后，进行测定，根据回归方程计算含量。

1.3.5 差异性成分的测定[20]

采用液相色谱-质谱联用仪检测。实验的仪器分析平台为LC-Q-TOF-MS系统，分离色谱柱为C18色谱柱（100 mm×2.1mm，1.8μm）。色谱分离条件为：柱温35℃；流速0.5mL/min；流动相组成A：乙腈，B：水（含0.2%甲酸）；ESI正、负离子采集数据，进行梯度洗脱（0～5 min，10%A；5～20 min，10%A→20%A；20～30 min，20%A→90%A；30～40 min，90%A→5%A）。

1.3.6 数据处理

采用Excel 2010、SPSS17.0和T检验（P＜0.05）进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛发酵前后性质分析

发酵前后的理化指标及活性成分变化见表1。

表1 发酵前后的理化性质及活性成分变化Table 1 Changes of physicochemical properties and active components before and after fermentation

由表1可知，经混合菌发酵后铁皮石斛酒的pH值由6.20降至3.75，总酸含量增加至0.98%，酒精度增加至5.2%vol，可溶性固形物含量由17%下降至8%。产乳酸芽孢杆菌主要产生乳酸[21]，其代谢产物使得样品溶液中总酸含量升高，pH降低。而经乳酸芽孢杆菌和酿酒酵母菌发酵的铁皮石斛酒能达到色泽均匀、酸度适宜、口感柔和、香气宜人的效果。

混合菌发酵铁皮石斛液中的多糖含量增加至4.99 g/L。混合菌发酵使多糖含量增加，增加的部分多糖可能是胞外多糖（exopolysaccharides，EPS），更可能的是在发酵过程中，物质传递效率高，促进了铁皮石斛中多糖的溶出，增加了铁皮石斛酒的活性成分含量。铁皮石斛样品经混合菌发酵后，总花色苷含量由11.06 mg/L升高至16.82 mg/L，上升了50%。混合菌发酵提供的酸性环境，有利于铁皮石斛发酵酒中花色苷的保存，提高其稳定性[22]，且样品经过发酵，能够调节溶液的渗透压、pH值、水分活度等[23]，从而相应地提高花色苷类物质的溶出率，增加铁皮石斛发酵酒营养成分的含量。

2.2 铁皮石斛发酵酒红色素的检测分析

未发酵时的铁皮石斛汁液由于富含花色苷呈浅紫色[24]，而经过发酵后的铁皮石斛发酵酒呈粉红色，为了判别铁皮石斛发酵酒中花色苷成分是否被破坏，采用LC-MS分析系统及ESI-MS系统对铁皮石斛发酵酒中的红色素进行了分析，结果见图1、图2。

图1 铁皮石斛酒红色素的液相色谱图Fig.1 Liquid chromatography of Dendrobium candidum wine red pigment

图2 铁皮石斛酒红色素鉴定出的花色苷Fig.2 Anthocyanins identified from Dendrobium candidum wine red pigment

由图1可知，铁皮石斛发酵酒红色素液相色谱图有三个较明显的峰，分别在23 min、25 min和28 min处有吸收峰。由图2可知，经过质谱分析实验、离子碎片分析以及比对参考文献，从铁皮石斛发酵酒中只鉴定出了飞燕草素-3-O-p-香豆酰葡萄糖苷，该物质为红色素的主要成分。

2.3 发酵前后有机酸组成及含量分析

发酵前后的有机酸组成级含量分析结果见图3。由图3可知，发酵前铁皮石斛中有机酸主要为苹果酸和柠檬酸。经产乳酸芽孢杆菌和酿酒酵母菌混合发酵后，酒石酸含量增加至280.39 mg/L；乳酸含量增加至126.28 mg/L；苹果酸含量由53.01 mg/L下降至33.86 mg/L；乙酸含量由0.3 mg/L增加至55.19 mg/L；柠檬酸含量由3.1 mg/L增加至16.78 mg/L。在发酵过程中产乳酸芽孢杆菌产生口感柔和的乳酸，中和了苹果酸引起的涩味，改善了石斛酒的口感。短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）能够参与肠道免疫稳态的调控，乙酸作为常见的SCFA之一，是胆固醇的主要来源，可被脑、心脏和肌肉等多种组织器官利用[25]，而柠檬酸能够保护细胞和组织损伤[26]。因此，发酵后酒体中乳酸、乙酸、柠檬酸含量明显增加，提高了铁皮石斛酒的营养价值，具有更佳的保健效果。

2.4 发酵前后酒体中组分的差异性分析

发酵前后发酵系统中化合物的主成分分析（principal component analysis，PCA）结果见图4，火山图见图5。

图4 发酵前后石斛酒成分的主成分分析结果Fig.4 Principal component analysis results of components of Dendrobium candidum wine before and after fermentation

图5 发酵前后石斛酒成分分析火山图Fig.5 Volcano plot of composition analysis of Dendrobium candidum wine before and after fermentation

由图4、图5可知，经主成分分析，主成分1（PC1）值为81.42%，主成分2（PC2）值为5.4%，从离散程度看，发酵前后的样品分别聚为一类，说明发酵前后组分差异显著。火山图中红色标记的化合物即为通过了T测验（P＜0.05）及FC＞2.0筛选出来的对应组间差异物质。经软件检索鉴定发酵后显著差异物质，可以发现，混合菌发酵后共产生了6种化合物，其中5种含有羧基官能团，分别为2，5-二羟基-3-噻吩羧酸、（4-羟基丁氧基）乙酸、5-（羟基甲基）-1,3-二氧戊环-4-羧酸、（2S，3R）-3-（羟甲基）-2-环氧乙烷羧酸、（2S，3R）-2,3-二羟基-4-氧代丁酸，可能是发酵过程中产生的各种有机酸反应而取代，酯类物质（丁酸羟基甲酯）则是混合菌发酵产生的代谢产物。发酵产生的有机酸化合物及酯类化合物，不仅改善了铁皮石斛酒的口感，还赋予其独特的香气，使产品效果更佳。

3 结论

本实验在最优发酵条件下（产乳酸芽孢杆菌∶酿酒酵母=1∶10（V/V），2%菌种活化液，发酵温度30 ℃，发酵时间7 d）混合发酵铁皮石斛，发酵后铁皮石斛酒的pH值由6.20降至3.75，总酸含量上升至0.98%，酒精度增加至5.2%vol，可溶性固形物含量由17%下降至8%。发酵后铁皮石斛酒中活性成分含量增加，其中多糖含量增加至4.99 g/L，花色苷含量由11.06 mg/L增加至16.82 mg/L。有机酸含量也发生明显变化，其中酒石酸含量升高至280.39 mg/L，乳酸含量升高至126.28 mg/L，苹果酸含量由53.01 mg/L降低至33.86 mg/L，乙酸含量由0.30 mg/L升高至55.19 mg/L，柠檬酸含量由3.10 mg/L升高至16.78 mg/L。同时，发酵前后组分差异显著，发酵后产生了6种化合物，分别为2,5-二羟基-3-噻吩羧酸、（4-羟基丁氧基）乙酸、5-（羟基甲基）-1,3-二氧戊环-4-羧酸、（2S，3R）-3-（羟甲基）-2-环氧乙烷羧酸、（2S，3R）-2,3-二羟基-4-氧代丁酸。因此混合菌发酵，不仅保留了铁皮石斛中的营养成分，而且提高了原料中活性成分的溶出率，并且兼备经产乳酸芽孢杆菌和酿酒酵母菌发酵代谢产生的生理功效，提高了铁皮石斛酒的保健作用，为铁皮石斛保健产品的新研发提供参考。