奈诺沙星对嗜肺军团菌体外抗菌活性的研究

董 颖，陈莹莹，魏彤竹，陈 愉*

0 引言

军团菌(Legionella)是引起流行性、散发性社区获得性肺炎和医院内获得性肺炎的重要致病菌[1],军团菌感染后引发的疾病称军团菌病(Legionnaires′ disease,LD)，临床症状可轻可重，其中最多见且最严重的临床类型为军团菌肺炎，并且常伴有中枢神经系统、心脏、肝脏、胃肠道和肾脏等肺外并发症的存在[2-4]。该病病情进展快，且病死率高[5-6]，其中嗜肺军团菌(Legionellapneumophila,LP)的1型为主要致病菌，但其他菌型也可致病[7-8]。军团菌在自然水环境中普遍存在，并且经常污染人工水系统[9-11]，目前，对环境分离的军团菌菌株和临床分离的军团菌菌株药物敏感性的比较鲜有报道。军团菌治疗可选择的药物有限，有些病例虽然应用了抗军团菌的治疗，仍然不能逆转其病程。研发新型抗军团菌药物并对其进行深入研究将对提高军团菌的治愈率起到有益的作用。奈诺沙星是一种新型无氟喹诺酮类广谱抗菌药物，其对军团菌的药物敏感性尚未见报道。本研究探讨了奈诺沙星对嗜肺军团菌的体外抗菌活性，为临床治疗军团菌的药物选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 沈阳2012-2017年环境水中分离出的嗜肺军团菌菌株36株，从中国医科大学附属盛京医院、中国医科大学附属第一医院、沈阳市第四人民医院患者痰标本中分离培养的嗜肺军团菌菌株4株，共40株嗜肺军团菌菌株。其中经鉴定LP 1型 27株，LP 2型4株，LP 3型4株，LP 7型2株，LP 4型、6型、10型各1株。

1.2 仪器与试剂 奈诺沙星(批号：205MP161101，中国药品生物制品检定所)；阿奇霉素(批号：130352-201007，中国药品生物制品检定所)；左氧氟沙星(批号：130455-201106 中国药品生物制品检定所)；军团菌琼脂基础干粉(英国OXOID公司)；BCYE添加剂(英国OXOID公司)；无菌缓冲酵母提取物肉汤(Buffered yeast extract broth,BYEB)；缓冲活性炭酵母浸液琼脂(Buffered charcoal yeast extract,BCYE)；比浊仪(Micro Scan Turbidity Meter，SIEMENS)；二氧化碳恒温培养箱(Thermo Scientific)。

1.3 方法 细胞外药敏试验采用的是微量肉汤稀释法[12]，药敏试验参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)制定的标准，将嗜肺军团菌菌株恢复室温后，在BCYE培养基培养并传代2次，制备肉汤后用肉汤增菌2代，调整菌悬液浓度至浊度为0.5麦氏浓度，之后稀释至2～8×105CFU/ml备用。实验药物溶解后配制成终浓度为512 mg/L，二倍稀释至0.002 mg/L。用96孔U型板，每孔加入50 μl药物，再加入50 μl菌悬液，留有空白对照孔。将96孔U型板置37 ℃、2.5%CO2的湿润恒温箱中孵育72小时观察结果，记录最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC)。统计MIC50、MIC90、MBC50、MBC90值。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213。

2 结果

2.1 最低抑菌浓度MIC 3种药物对40株嗜肺军团菌的MIC结果见表1。奈诺沙星的MIC90值最小，其次为左氧氟沙星；阿奇霉素的MIC50和MIC90值均为最大。由结果可见3种药物对嗜肺军团菌均有较好的抗菌活性，喹诺酮类药物敏感性强于大环内酯类药物。

2.2 最低杀菌浓度MBC 3种药物对40株嗜肺军团菌的MBC结果见表2。奈诺沙星的MBC90值最小，左氧氟沙星MBC90值稍大，阿奇霉素MBC50和MBC90值均最大。结果提示，喹诺酮类药物对军团菌具有良好的杀菌作用，阿奇霉素杀菌作用较弱，MBC分布范围较大。

表1 3种药物对40株嗜肺军团菌的MIC(mg/L)

表2 3种药物对40株嗜肺军团菌的MBC(mg/L)

2.3 按菌株来源分类的MIC值比较 不同来源菌株的MIC值见表3。由结果可见，对于环境分离株而言，奈诺沙星抗菌作用最强，而对于临床株而言，左氧氟沙星抗菌作用最强。奈诺沙星对2种不同来源的菌株MIC值没有差异，都有较好的抗菌活性，而左氧氟沙星MIC90值在环境分离菌株组稍高。阿奇霉素对2种不同来源的菌株MIC50和MIC90值均高于其他2种药物，对环境分离株的抗菌活性最差。

表3 不同来源菌株的MIC值比较(mg/L)

2.4 按菌株来源分类的MBC值比较 奈诺沙星和左氧氟沙星对于不同来源的菌株均有较好的杀菌作用，两者均强于阿奇霉素。对于环境分离菌株而言，奈诺沙星杀菌作用最强；对于临床株而言，左氧氟沙星杀菌作用最强。左氧氟沙星和阿奇霉素两种药物对临床菌株杀菌效果强于环境分离菌株。见表4。

表4 不同来源菌株的MBC值比较

2.5 LP1型和非LP1型嗜肺军团菌的MIC(mg/L)值的比较 LP1型和非LP1型嗜肺军团菌的MIC值见表5。结果显示，奈诺沙星和左氧氟沙星对LP1型和非LP1型军团菌的药物敏感性基本一致，而阿奇霉素对两组的敏感性稍有不同，就MIC50而言，阿奇霉素对LP1型的抗菌活性弱于非LP1型。

表5 LP1型和非LP1型嗜肺军团菌的MIC值比较

2.6 LP1型和非LP1型嗜肺军团菌的MBC(mg/L)值比较 LP1型和非LP1型嗜肺军团菌的MBC值见表6，结果显示，奈诺沙星和阿奇霉素对LP1型的杀菌作用弱于非LP1型，以阿奇霉素尤为明显，而左氧氟沙星的MBC90在LP1型稍低于非LP1型，提示对非LP1型杀菌活性较LP1型稍强，且其MBC范围的数值较小。

表6 LP1型和非LP1型嗜肺军团菌的MBC值比较

3 讨论

自1977年美国疾病控制中心(CDC)首次描述军团病以来[13]，其发病率逐年增高，引起国内外学者们的普遍关注。军团菌属于革兰阴性菌，包括59个种和3个亚种，嗜肺军团菌是最常见的种[14]。迄今已知约30种军团菌可引起人类感染，其中已确认嗜肺军团菌种的16个血清型均可引起感染[15]，多为下呼吸道感染。军团菌可以在阿米巴原虫、人巨噬细胞和肺泡上皮细胞内寄生及繁殖。抗菌药物需要穿透细胞膜进入细胞内才能更有效地杀灭军团菌。目前，细胞穿透性强的脂溶性药物(如喹诺酮类和大环内脂类药物)是抗军团菌的主要选择用药，然而，有研究发现军团菌已出现了对2类药物耐药。有学者对149株LP1型嗜肺军团菌药敏实验发现，红霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平对军团菌均敏感，其中25株对阿奇霉素耐药，并且提示阿奇霉素敏感性的降低与其LpeAB基因的表达有关[16]。在2019年的研究中发现，122株嗜肺军团菌菌株中发现1例临床LP1型对阿奇霉素(MIC 0.5～1 mg/L)敏感性降低，并含有外排泵成分LpeAB[17]。本研究对40株军团菌的药敏实验发现，MIC>1 mg/L的菌株有10株，均来自环境，其中LP 1型7株，LP 2型、LP 3型、LP 4型各1株，同样提示阿奇霉素的敏感性下降，具体耐药机制有待于深入研究。

关于军团菌对氟喹诺酮类药物的耐药，2012年曾有1篇个案报道。1名重症肺炎患者入院后应用头孢唑林和庆大霉素抗感染治疗，在查出军团菌尿抗原阳性后改用环丙沙星400 mg，每天2次，在环丙沙星抗感染治疗4 d后支气管肺泡灌洗液培养出LP1型军团菌。药敏试验显示，环丙沙星对该菌株的MIC值为2 mg/L，超出了抗菌药物的流行病学界值(ECOFF)1 mg/L[18]。后续基因检测显示，菌株DNA旋转酶的gyrA基因QRDR产生了点突变，导致了83位氨基酸的异位[19]。gyrA是氟喹诺酮类药物对嗜肺军团菌的作用靶点，其突变会降低DNA旋转酶对氟喹诺酮类药物的敏感性[20]，进而产生耐药。另一项研究同样发现在82名军团菌肺炎患者分离的军团菌菌株中检测到2株gyrA83突变[21]，QRDR信号中的gyrA83突变与氟喹诺酮类药物对嗜肺军团菌的MIC值增加有关。本研究的40株军团菌中，奈诺沙星和左氧氟沙星的MIC最大值均为0.5 mg/L，提示尚未出现菌株的耐药基因突变。

以上研究说明虽然氟喹诺酮类和大环内酯类药物对军团菌有很高的活性，但已出现了耐氟喹诺酮类和大环内酯类药物的军团菌菌株。因此，在临床应用氟喹诺酮及大环内酯类药物进行抗军团菌治疗时，若临床疗效欠佳，应考虑其可能的耐药性，并且不断探索新药对军团菌的作用，以增加抗军团菌的药物选择。

奈诺沙星是TaiGen生物公司开发的一种新型的非氟喹诺酮类抗菌药物，化学式是C20H25N3O4·C4H6O5·1/2 H2O，现应用于临床的药物为苹果酸奈诺沙星。奈诺沙星与其他氟喹诺酮类药物不同之处在于其C-6位缺少氟原子，这一改变使DNA旋转酶抑制作用增强了10倍以上，对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等30种细菌的MIC降低至原来的1/100[22]。其生物利用度约为95%，与左氧氟沙星和莫西沙星相似[23-24]。国内完成的奈诺沙星的Ⅰ～Ⅲ期临床试验表明，该药物口服后在健康受试者体内吸收迅速，半衰期长，约为11 h。大约70%的给药药物是由肾脏排泄的，耐受性良好[25]。第Ⅱ期及第Ⅲ期临床研究也显示，口服奈诺沙星(500 mg/d，连用7～10 d)与口服左氧氟沙星(500 mg/d)治疗轻至中度CAP的临床及微生物学疗效相同[26-27]。奈诺沙星对革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌都具有较强的广谱抗菌活性，与同类的氟喹诺酮类抗菌药物相比，奈诺沙星对于革兰阳性球菌具有更高的抗菌活性[27]。对于非典型病原体，研究发现奈诺沙星对147株支原体临床分离株的活性均与左氧氟沙星、环丙沙星相似[28]。军团菌与支原体、衣原体同为非典型病原体，目前临床研究发现，奈诺沙星对军团菌具有很好的临床疗效，但奈诺沙星对军团菌的药敏情况及抗菌活性尚未见报道。

本实验研究了新型无氟喹诺酮类药物奈诺沙星对嗜肺军团菌的体外药物敏感性，并与新大环内酯类药物阿奇霉素及氟喹诺酮类药物左氧氟沙星进行了对比，结果发现奈诺沙星对嗜肺军团菌具有良好的体外抗菌活性，喹诺酮类药物敏感性强于大环内酯类药物。在日本学者的1项58株临床军团菌菌株的体外药敏结果可见，左氧氟沙星的MIC值范围为0.004～0.03 mg/L，MIC90值为0.015 mg/L，阿奇霉素的MIC值范围为0.001～0.12 mg/L，MIC90值为0.06 mg/L[29]，提示喹诺酮类药物对于军团菌的敏感性强于大环内酯类。此外，意大利学者做了1项100株环境中军团菌菌株的药敏实验，结果显示，左氧氟沙星的MIC90为0.094 mg/L，阿奇霉素的MIC90为0.25 mg/L，由此可见，左氧氟沙星对意大利环境中提取的军团菌的抗菌作用优于阿奇霉素[30]。广州的1项60株环境提取的军团菌药敏试验结果显示，左氧氟沙星MIC90为0.031 mg/L，阿奇霉素MIC90为0.5 mg/L，同样说明左氧氟沙星对环境军团菌的效果优于阿奇霉素[31]。本实验结果显示奈诺沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素分别为0.031～0.5、0.004～0.5、0.062～4 mg/L，MIC50分别为0.062、0.031、1 mg/L；MIC90分别为0.125、0.5、4 mg/L，MBC分别为0.062～1、0.008～2、0.125～8 mg/L，MBC50分别为0.125、0.125、2 mg/L，MBC90分别为0.5、1、8 mg/L，提示奈诺沙星和左氧氟沙星对军团菌的敏感性均明显强于阿奇霉素，在细胞外具有良好的抑菌和杀菌作用，且奈诺沙星的作用优于左氧氟沙星。将本实验研究结果与其他几项实验结果对比发现，本地区嗜肺军团菌的敏感性较其他地区差，尤其阿奇霉素耐药性增高，提示可能出现耐药基因突变，同时提示不同区域军团菌菌株存在敏感性的差异，不同区域菌株敏感性的数据对指导当地临床治疗更有实际意义，在临床用药过程中应予以重视。

对于不同来源的嗜肺军团菌菌株药物敏感性的对比研究，在国内外尚未查到相关文献报道，而本实验结果显示，两组略有差别。本研究通过对比环境及临床军团菌菌株的MIC50、MIC90、MBC50、MBC90值，结果显示，奈诺沙星在两组敏感性方面基本一致，而左氧氟沙星和阿奇霉素对于临床军团菌菌株更敏感，而对环境分离军团菌菌株的抑菌和杀菌效果较弱，提示环境中的多种因素均可能诱发细菌耐药性增强。奈诺沙星对环境及临床菌株均敏感，其原因可能是奈诺沙星为一种新药，人体内尚未产生耐药，而且对环境菌株药物诱导耐药压力较小。由于本实验临床菌株数量较少，该结果也可能与样本量小有关，需要大样本实验加以验证。

关于LP1和非LP1型嗜肺军团菌菌株的对比，波兰的1项28株的环境军团菌药敏提示，阿奇霉素对LP1型军团菌(n=16)的MIC90值为0.25 mg/L，对非LP1型军团菌(n=12)的MIC90值为0.47 mg/L[32]，由此看出，阿奇霉素对不同分型的军团菌的药物敏感性是不同的，对非LP1型菌株敏感性稍差。日本的军团菌药敏实验中，左氧氟沙星对LP1型军团菌(n=46)的MIC范围为0.004～0.03 mg/L，MIC90值为0.015 mg/L，对非LP1型军团菌(n=12)的MIC范围为0.000 8～0.015 mg/L，MIC90值为0.015 mg/L，阿奇霉素对LP1型军团菌的MIC范围为0.001～0.012 mg/L，MIC90值为0.006 mg/L，对非LP1型军团菌的MIC范围为0.015～0.06 mg/L，MIC90值为0.003 mg/L[29]，可看出对比不同分类的军团菌，药物的作用效果不同，提示左氧氟沙星对两组敏感性无差异，而阿奇霉素对LP1型的军团菌MIC值范围总体更小，敏感度略高于非LP1型的军团菌。本研究中，奈诺沙星对于LP1型军团菌和非LP1型军团菌的药物敏感性基本一致，而左氧氟沙星对LP1作用稍强，而阿奇霉素对非LP1型军团菌抗菌活性稍强，与国外研究结果有所不同，此差异可能与不同区域菌株分布不同有关，另需大样本菌株进行深入研究。

综上所述，奈诺沙星作为无氟喹诺酮类新药，对嗜肺军团菌显示了良好的体外抗菌活性，明显优于阿奇霉素，略优于左氧氟沙星。该研究为奈诺沙星抗军团菌感染提供了药物敏感性的理论基础，对临床军团菌治疗的药物选择具有指导意义。