ICP-MS同时测定不同产地制草乌药材中6种重金属的含量及聚类分析

2020-06-08胡国辉谭丽盈梁文能

实用药物与临床 2020年2期

胡国辉，谭丽盈，梁文能

0 引言

草乌为毛茛科植物北乌头AconitumkusnezoffliReichb.的干燥块根，通常在秋季茎叶枯萎时候采挖，除去须根和泥沙，干燥后备用。草乌性辛，苦、热，有大毒，故临床使用多为其炮制品，具有除湿祛风、温经止痛等作用，主要用于治疗由风寒湿痹引起的关节疼痛、心腹冷痛等症状[1-3]。草乌在本草十八反中有“半篓贝蔹及攻乌”之说，因此，在使用中应注意其配伍禁忌。草乌中的主要成分为双酯型生物碱，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱是其止痛麻醉的主要活性成分[4-5]，目前已有草乌中挥发油含量及有机农药残留测定的报道[6-7]，而重金属中，只有铅、镉、砷、汞4种元素测定的相关研究[8]，未见同时测定6种重金属的报道。重金属是指一类对人类身体有害的金属元素，会影响中药药效。近年来，由于环境污染，造成对土壤的重金属等污染，从而影响了各种中药材的生长和质量[9-10]，而草乌药材使用的是其干燥块茎部，其污染更直接。由于重金属在人体内易于累积，难以排除，且在人体易于和酶蛋白结合，使蛋白质失去活性，进而损伤人体组织细胞，同时会破坏人体的免疫系统和损伤器官[11]，如果服用含有重金属污染超标的药材，不仅起不到治疗药效，甚至会给身体带来一定的伤害，因此，有必要对草乌药材中有害重金属进行定量。

目前，对中药材的重金属测定主要有试管比色法、原子吸收光谱法[12]、原子荧光光谱法[13]、ICP-OES[14]法、ICP-MS[15-16]法等。各种方法均有其各自的特点和使用范围，《中国药典》2015年版四部收载的为原子吸收光谱法和ICP-MS法，电感耦合等离子体法因其具有较高灵敏度和检出限，是目前公认的同时测定多种痕量元素的常用方法，因此，广泛用于食品、药品、环境等各个行业。故本文参考2015年版《中国药典》四部重金属指导原则和相关文献[17]，建立ICP-MS同时测定草乌药材中6种有害重金属元素的含量，并采用聚类分析对其结果进行质量评价，从而为保证其临床用药安全提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent7500A型电感耦合等离子体质谱仪(美国安捷伦公司)；MARS6微波消解仪(美国培安仪器有限公司)；Sartorius BP210S电子分析天平(德国赛多利斯有限公司)。

1.2 标准物质与试药 Pb、Cd、As、Cu、Cr等多元素标准溶液(1 000 μg/ml)，批号：GNM-M251678-2016；内标溶液 Bi、Ge、Sc、In等元素的标准溶液(1 000 μg/ml)，批号：GSB 04-1719-2004，Au单元素标准溶液(1 000 μg/ml)，批号：GSB 04-1715-2004，均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心，Hg单元素标准溶液(1 000 μg/ml)，批号：GBW08617，购自中国计量科学研究院；KED调谐液(美国Agilent公司)；65%优级硝酸购自美国Merck股份两合公司，水为超纯水(美国Millipore公司)，容量瓶和移液管均为聚乙烯塑料瓶(德国布兰德公司)，12批草乌药材来自6个产地，均购自广州清平中药材市场。所购药材均经梁文能副主任中药师鉴定，为毛茛科植物北乌头AconitumkusnezoffliReichb.的干燥块根。见表1。

2 方法与结果

2.1 ICP-MS工作条件 ICP-MS仪器参数：RF发射功率1 300 W，雾化气流速0.87 L/min；辅助气体流量1.0 L/min；冷却气体流量18.0 L/min；采样深度7.2 mm，样品提升速率1.0 L/min，液氩压力0.6 mPa；脉冲电压850 V；样品冲洗时间40 s；延迟16 s；数据采集模式全定量方式；读数时间3 s，每个样品测定3次。测定时选取同位素208Pb和202Hg以209Bi做内标物，114Cd以115In做内标物质，52Cr以47Sc做内标物，63Cu、75As以Ge做内标物质。

表1 12批不同产地草乌药材样品的来源

2.2 溶液的制备

2.2.1 标准储备溶液的制备分别精密吸取“1.2”项下的Pb、Cd、As、Cu、Cr的多元素标准溶液1 ml以及Hg单元素标准溶液1 ml置同一100 ml量瓶中，用2%硝酸稀释至刻度，摇匀，作为对照品混合溶液(每1 ml分别含Pb、Cd、As、Cu、Hg、Cr 10 μg)。

2.2.2 标准溶液的制备精密量取“2.2.1”项下的混合标准储备液适量，用2%硝酸分别稀释制成每1 ml中含Pb 5、10、20、30、40 ng，Cd 0.5、1、2、3、4 ng，Cr 5、10、15、20、30 ng，Cu 0.04、0.2、0.4、0.6、0.8 μg，As 2、6、10、16、20 ng，Hg 2、6、10、14、18 ng的系列标准溶液，同时取2%硝酸作为标准品的空白溶液。

2.2.3 内标溶液的制备精密量取“1.2”项下的Sc、Bi、Ge和In单元素标准溶液1 ml置100 ml量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀作为内标溶液的储备溶液，精密吸取上述内标溶液的储备溶液1 ml置100 ml量瓶中，用超纯水稀释至刻度，作为内标混合溶液(每1 ml分别含Sc、Bi、Ge、In 0.1 μg)。

2.2.4 供试品溶液的制备取四川成都产的制草乌药材，粉碎，过二号筛，粉末备用，精密称取上述粉末0.5 g，置聚四氟乙烯微波消解罐中，加入硝酸10 ml，混匀，浸泡过夜，然后置于微波消解仪中，按表2中微波消解程序进行消解。消解完成后，用赶酸器将消解液挥发至约1～2 ml时，用水少量多次转移至50 ml聚四氟乙烯容量瓶中，加入Au单元素标准溶液(1 μg/ml) 200 μl，加水稀释定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液，同时制备样品空白溶液。

表2 微波消解仪工作条件

2.3 线性关系考察取“2.2.2”项下混合标准系列溶液，按照“2.1”项下的ICP-MS仪器工作条件进行测定，采用“2.2.3”项下0.1 μg/ml的内标溶液作为校正，依次将进样管插入各个混合标准系列溶液中测定，内标管插入内标溶液中，以各个元素测量的信号值为纵坐标Y，相对应的浓度(ng/ml)为横坐标X，进行线性回归。结果各元素线性方程及相关系数等参数见表3。

表3 线性方程及相关参数

2.4 精密度试验在“2.2.2”项下的各元素线性范围内，分别取各个元素的低、中、高3种不同浓度的混合标准系列溶液，按“2.1”项下的仪器条件进行测定，每种浓度重复测定6次，记录信号值，结果显示，RSD均在5%之内，表明该仪器的精密度良好。见表4。

表4 精密度试验结果(%)

2.5 重复性试验精密称取四川成都产的制草乌药材粉末0.5 g，同时制备6份样品，按“2.2.4”项下的供试品溶液方法制备，按照“2.1”项下条件进行测定，分别计算6种元素的含量，结果Pb、Cd、Cr、Cu、Hg、As的平均含量为0.240 5、0.028 7、0.289 6、2.825 0、0.041 5、0.135 2 mg/kg，RSD分别为4.02%、4.86%、3.23%、1.22%、1.79%、2.65%，表明样品的重复性良好。

2.6 稳定性试验精密称取四川成都产的制草乌药材粉末0.5 g，按“2.2.4”项下的供试品溶液制备方法制备，按照“2.1”项下的仪器条件分别于0、1、2、4、8、12、16、20、24 h进样测定，记录各元素的信号值。结果Pb、Cd、Cr、Cu、Hg、As各元素RSD值分别为4.15%、3.26%、2.78%、1.16%、2.56%、2.68%。结果表明，该供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验精密称取已知含量四川成都产的制草乌药材粉末0.25 g，置聚四氟乙烯消解罐内，同时制备6份样，另取“2.2.1”项下的多元素混合标准和Hg单元素标准溶液，用水稀释成每1 ml含Pb、Cr、As各0.1 μg/L，Cd、Hg各0.01 μg/L，Cu 1 μg/L的混合标准溶液，作为加标溶液，分别向上述6份样品中加入加标溶液各1 ml，然后按“2.2.4”项下的供试品溶液制备，同时做样品空白，按“2.1”项下的仪器工作条件进行测定，分别计算各元素加样回收率，测定结果见表5。

2.8 样品测定取上述12个不同产地的制草乌药材，按“2.2.4”项下的供试品溶液制备方法制备，同法制备空白溶液，按“2.1”项下的仪器条件进行测定，测定结果见表6。

2.9 聚类分析实验对上述12个不同产地的制草乌药材中6种重金属含量的结果，采用SPSS 20.0统计软件对其进行聚类分析，采用组间联接方法，平均Euclidean距离，进行层次聚类，结果当平均Euclidean距离为5时，12批样品共分为四大类，见图1，其中S2号(吉林长春)、S9号(安徽合肥)为第1类；S10号(河南信阳)、S12号(河北保定)为第2类；S6号(内蒙古赤峰)为第3类；S8号(山东临沂)、S11号(贵州铜仁)、S5号(湖南娄底)、S7号(新疆伊犁)、S3号(陕西汉中)、S4号(陕西商洛)、S1号(四川成都)为第4类，聚类结果显示同一类之间的重金属含量结果相似度较高，不同类之间差异较大，因此，可以初步判断不同产地制草乌药材中重金属含量的差异。

表5 加样回收率试验结果

表6 不同产地制草乌药材测定结果(mg/kg)

注：“ND”表示未检出

图1 制草乌药材中6种重金属系统聚类分析结果

3 讨论

3.1 消解酸体系的选择首先将制草乌药材进行粉碎，过二号筛备用，分别采用HNO3、HNO3-HCl(9∶1)、HNO3-H2O2(8∶2)、HNO3-HF(9∶1)等体系进行消解样品。结果显示，上述4种体系的酸都可以把制草乌药材消解完全，且消解液均为澄清透明无残渣。但是考虑到使用的酸体系越复杂，对实验的测定干扰就越大，而且在ICP-MS测定中酸体系越多，引入的元素就越多，越会影响测定结果的准确性。采用HNO3-HCl(8∶2)作为消解液时，会引入Cl，Cl与Ar形成40Ar35Cl而干扰75As的测定，如果采用HNO3-HF(9∶1)体系，会引入HF。在赶酸过程中，如果HF赶酸不彻底，会对仪器的雾化室、通透镜、采样锥和炬管产生一定的腐蚀作用，进而影响仪器的使用寿命。实验中发现，如果采用HF，需要在赶酸近干时，多次少量加水进行赶酸，从而保证HF彻底挥发，最后综合考虑并参考2015年版《中国药典》四部重金属的指导原则，采用HNO3作为制草乌药材的消解体系。由于所测重金属元素为痕量物质，因此，实验所用的移液管和容量瓶均为聚乙烯塑料材质，使用前需用20%硝酸溶液浸泡过夜，减少污染，从而保证数据的准确性。

3.2 供试品的制备本研究发现，汞元素的回收率较低，基本为50%～60%，通过多次实验发现，在供试品制备的过程中，赶酸温度影响很大。如果超过140 ℃进行赶酸，汞元素会挥发掉，影响结果的准确性，如果在80 ℃以下赶酸，回收率基本可以在80%以上。因此，实验中，赶酸需要温度较低，从而保证汞元素的测定。汞具有强的吸附性，极易附着在仪器的采样锥、样品管和矩管上，影响其他元素的测定，因此，在样品中要加入一定的Au元素标准溶液。由于汞可以与金形成金汞齐，使其溶解，减少仪器污染，从而保证测定结果的准确性。

3.3 ICP-MS的优点 ICP-MS在测定重金属时具有较高的灵敏度和准确性，在测定中为了使仪器的灵敏度最高，减少相互之间的干扰，补偿基体效应，依据质量数相近，电离电位相近的原则选择47Sc作为Cr、209Bi作为202Hg和208Pb、72Ge作为64Cu和75As、115In作为114Cd元素的内标溶液，结果发现可以减少元素直接的干扰，保证结果的准确性，同时采用ICP-MS同时测定多种元素，具有分析速度快、灵敏度高、一次进样测定多个元素的优势，从而缩短实验时间，提高实验效率，因此，本实验采用ICP-MS法同时测定12批不同产地的制草乌药材中6种重金属元素，解决了原子吸收、原子荧光光谱等仪器对重金属元素逐个分析的现状，大大提高了工作效率。

3.4 结果的判定目前2015年版《中国药典》仅对西洋参、黄芪、枸杞子等部分药材的重金属做了限度要求，其余大部分药材中重金属尚未制定标准，参考《中国药典》部分药材的规定以及《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》对重金属的规定为铅≤5 mg/kg，镉≤0.3 mg/kg，铬≤2 mg/kg，铜≤20 mg/kg，汞≤0.2 mg/kg，砷≤2 mg/kg。实验通过对不同产地的12批制草乌药材中6种重金属的测定，发现12批不同产地的制草乌药材中，铅、铬和铜的合格率为100%，没有超标现象。河南信阳产地草乌药材中镉、汞和砷均有超标现象。河北保定仅有砷元素超标，总体质量比较良好，超标的原因可能是由于当地长期施用工业磷肥中的镉和砷造成的，以及与当地的植物生长的土壤环境有关，应引起当地监管部门的注意。为了防止重金属污染，必须从源头做起，如在具有优良GAP的产地进行种植和栽培，严格控制药材生长的环境、化肥等，从而保证药材的安全性和有效性。建议制草乌药材的质量标准中增加重金属的检查项目。