人参皂苷联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠阿尔茨海默病模型学习记忆能力及神经元再生的影响

张 艳,马 莉,杨 爽,潘广雯,樊 榕

0 引言

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是神经内科临床常见的一种中枢神经系统进行性发展的退行性疾病，病理特征为大脑海马区出现老年斑、神经元数目减少、神经纤维缠结、海马锥体细胞颗粒空泡变性、β淀粉样蛋白沉积等，临床症状表现为记忆障碍、行为障碍、认知功能下降等，病变可累及运动、神经、泌尿等多个系统，导致患者逐渐丧失自理能力，严重影响其身心健康和生活质量[1-2]。AD的病因及发病机制尚未明确，认为可能与老龄、头部外伤史、雌激素缺乏、代谢、环境、遗传等有关。治疗以药物治疗、行为矫正为主，常用的药物包括胆碱能药物、抗氧化剂、脑细胞代谢激活剂等[3]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)能够产生多种细胞因子如脑源性神经营养因子、神经生长因子等，具有神经营养的作用，但BMSCs在体内分化率、存活率较低；人参皂苷是中药人参中的活性成分，具有兴奋中枢神经、促进DNA及RNA合成、改善记忆与学习能力的作用，在体外环境下人参皂苷对BMSCs具有诱导分化的作用[4]。鉴于此，本研究旨在探讨人参皂苷联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠AD模型学习记忆能力及神经元再生的影响。

1 材料与方法

1.1 一般材料 实验动物：健康3月龄雄性SD大鼠45只(动物质量合格证号：SCXK2019-0003)，体重250～300 g，平均体重(274.75±18.72)g，均购自北京维通利华实验动物研究中心，SD大鼠单笼饲养，自由进食进水，通风良好、自然光照。主要仪器：山东博科QP80C02培养箱、LD400台式低速离心机、三目ZLD200-37T倒置相差显微镜、中西ZXKJ-HZ66-ZH动物脑立体定位仪、迷宫箱。主要试剂和药品：DAB底物显色试剂盒、SP即用型试剂盒、DMEM培养液(上海研生实业有限公司)、BI胎牛血清(上海唯问生物技术有限公司)、Percoll细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司)、胰蛋白酶(苏州甫路生物科技有限公司)、β淀粉样肽25～35(Aβ25～35，上海莼试生物技术有限公司)、1%伊红、0.5%苏木精。本研究经医院伦理委员会批准通过。

1.2 实验方法

1.2.1 制备45只SD大鼠AD模型 将Aβ25～35按照2 g/L溶于无菌生理盐水中，37 ℃培养箱中孵育7 d以上，使其变成聚集状态；按照0.3 g/kg腹腔注射水合氯醛(10%)使大鼠麻醉，将大鼠固定在立体定位仪上并明确大鼠双侧海马CA1区，用牙科钻在前囟向后3 mm、中线旁开2.2 mm处钻开颅骨，使用微量进样器从脑表面垂直进针2.8 mm，缓慢注入Aβ25～35，速度控制在1 μl/min，需留针10 min以使Aβ25～35溶液充分弥散，缓慢撤针并缝合切口。

1.2.2 分离培养骨髓间充质干细胞 使用脱臼法处死6周龄SD大鼠，置于75%酒精中浸泡消毒，于无菌操作室取下大鼠股骨，使用DMEM培养液反复多次冲洗股骨髓腔，然后利用尼龙网过滤细胞，加入等体积的Percoll细胞分离液，离心20 min(2 000 r/min)后收集细胞，再使用DMEM培养液反复冲洗2次，然后按照每瓶5×106将细胞接种在培养瓶中(含有DMEM培养液+10%胎牛血清)并进行纯化、扩增、传代，使用Brdu标记法标记传3代后的细胞，然后备用。

1.2.3 动物分组 将45只AD模型大鼠随机分为3组，各15只，A组大鼠采用骨髓间充质干细胞移植治疗。将麻醉后的大鼠固定在立体定位仪上并明确双侧海马区，将1 ml标记过并调整好浓度的骨髓间充质干细胞悬液置于离心管，使用高压消毒过的微量进样器吸取干细胞悬液并于每个移植点注射5 μl，注射速度控制在0.5 μl/min，留针10 min，缝合皮肤。B组大鼠在A组基础上予以腹腔注射人参皂苷Rg1，5 mg/kg，1次/d，持续治疗1个月。C组大鼠单纯腹腔注射5 μl生理盐水，持续治疗1个月。45只大鼠分开饲养1个月。

1.3 评价指标

1.3.1 三组大鼠学习记忆能力比较 分别于术后(干细胞移植前)、术后4周(干细胞移植后)采用Morris水迷宫进行定位航行试验，测定并比较三组大鼠的学习记忆能力。首先将实验室温度调整到24～25 ℃，在水迷宫中放入1 kg奶粉并用热水冲开，加水直至水面超过安全平台1 cm且水中不能明显看到安全平台，将水温控制在26 ℃左右，整个实验期间迷宫外设置足够多的参照物如门、窗、灯等，参照物需始终保持位置不变以供大鼠定位平台，将大鼠从4个入水点面向池壁放入水中，记录大鼠找到并爬上平台所需的时间(逃避潜伏期)；如果大鼠在1 min内没有找到平台，由实验者将大鼠引向平台，每天训练4次，上午2次，下午2次，每次间隔3 min，共训练4 d，大鼠找到并爬上平台的时间(逃避潜伏期)即代表大鼠的学习记忆能力，统计并计算大鼠平均逃避潜伏期成绩。

1.3.2 比较三组大鼠神经元再生情况 饲养1个月后，麻醉大鼠并取下其双侧海马，取材海马组织样本进行HE染色、免疫组化染色。

①HE染色：将取材样本置于中性福尔马林溶液(10%)中进行固定24 h，固定后使用流水冲洗取材样本24 h，常规石蜡包埋、切片，切片使用二甲苯脱蜡：将组织切片置入二甲苯中浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min，更换50%的二甲苯再浸泡5 min，然后水化。水化：无水乙醇浸泡5 min，更换无水乙醇浸泡5 min，更换95%乙醇浸泡5 min，更换90%乙醇浸泡5 min，更换89%乙醇浸泡5 min，更换70%乙醇浸泡5 min，蒸馏水洗2 min。使用伊红染色5 min，蒸馏水洗，然后脱水。脱水：依次使用70%、85%、95%、100%、100%的乙醇进行脱水，每步脱水时间为1 min。透明封片操作后在显微镜下观察。

②免疫组化染色：将取材样本置于多聚甲醛(4%)中进行固定24 h，固定后使用流水冲洗取材样本24 h，常规石蜡包埋、切片，切片脱蜡及水化(步骤同上)后，使用0.1 M pH 7.4磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次，5 min/次。向切片中加入过氧化物酶阻断溶液50 μl，室温孵育5 min后用PBS冲洗3次，5 min/次。将切片放入0.01 M pH 6.0抗原修复液(PBS稀释过)容器中，然后将其置于炉上加热直至温度达到92～98 ℃，保持12 min，关火并从炉上取下，待温度冷却到70 ℃后，用PBS冲洗3次，5 min/次。向切片中加入非免疫性动物血清50 μl，室温孵育10 min。除去多余血清后向切片中滴加适量一抗，37 ℃孵育1 h后，用PBS冲洗3次，5 min/次。向切片中加入生物素标记二抗50 μl，37 ℃孵育30 min后，用PBS冲洗3次，5 min/次。向切片中加入辣根过氧化物酶标记链酶亲和素溶液50 μl，37 ℃孵育15 min后，用PBS冲洗3次，5 min/次。向切片中加入DAB溶液100 μl后在显微镜下观察，控制反应时间并充分水洗切片以终止显色。然后苏木精染核-酒精脱水-二甲苯透明-中性树胶封片，所有切片标本均在同一显微镜下的同一放大倍数、同一光强度下进行观察，每张切片选取3个200×视野，细胞核呈棕黄色的即为BrdU阳性细胞，计数阳性细胞并以单个标本为单位计算平均值。

2 结果

2.1 学习记忆能力 C组移植前、后的逃避潜伏成绩相比，差异无统计学意义(P>0.05)；三组移植前逃避潜伏成绩相比，差异无统计学意义(P>0.05)；移植后，A组和B组的逃避潜伏成绩较移植前降低，A组、B组逃避潜伏成绩均低于C组且B组低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 神经元再生情况 A组和B组大鼠标本免疫组化染色后在显微镜下观察到存在BrdU阳性细胞，B组BrdU阳性细胞数多于A组，差异有统计学意义(F=13.26,P<0.05)[1]。见表2。

表1 三组大鼠逃避潜伏期成绩比较(s)

注：与C组比较，*P<0.05；与A组比较，#P<0.05

表2 A、B两组大鼠BrdU阳性细胞数比较(个)

3 讨论

随着人口老龄化的日益加剧，我国AD发病率逐年上升，多数AD患者在确诊后能生存8～10年[5]。AD的病因及病理机制虽不明确但存在多种学说，如Aβ学说、基因学说、胆碱能学说等。目前认为大脑内胆碱能神经细胞的退变是造成AD的重要病理因素之一，正常情况下中枢胆碱能神经可以合成大量的乙酰胆碱(ACh)，ACh经投射纤维输送到海马区和皮质区，海马区是学习记忆能力的重要解剖基础，中枢胆碱能神经传递则是学习记忆能力的重要生物学基础，AD患者中枢胆碱能神经元退变，进而引起ACh的合成、释放减少，导致记忆功能障碍、认知功能障碍等[6-8]。

本研究将BMSCs移植到大鼠双侧海马区，HE染色显示，A组大鼠切片表现为海马锥体细胞部分脱失、排列较为均匀，结构尚清晰，形态大致正常；B组大鼠切片表现为海马锥体细胞排列较为整齐均匀，结构清晰，形态基本正常；C组大鼠切片表现为海马锥体细胞脱失，排列不规则，部分细胞体积缩小、细胞核固缩、细胞浆浓缩深染；且水迷宫定位航行试验证实A组和B组大鼠的学习记忆能力优于C组，且B组优于A组，提示联合治疗效果确切，神经元再生明显，学习记忆能力得到改善，分析其原因，BMSCs是具有多向分化潜能及自我更新能力的成体干细胞，具有遗传背景稳定、来源广泛、分离培养容易、增殖能力强的特点[9-10]。骨髓来源的BMSCs不需要特异的分离方法就能达到分离纯化的目的，对细胞的损伤小，在体外适宜的条件下BMSCs可分化为神经细胞，将BMSCs移植到大鼠神经损伤微环境中，BMSCs存活并分化为神经组织组成细胞，替代病变的细胞，进而促进神经组织的再生修复；此外，BMSCs可以与宿主细胞融合，进而改变宿主细胞表型，有利于改善神经功能[11-12]。

中药人参具有大补元气、安神益智、复脉固脱、滋补强壮的功效。人参活性成分为人参皂苷。人参皂苷Rg1是人参皂苷中的一种，属于三醇类，可促进囊泡乙酰胆碱转运蛋白、胆碱乙酰转移酶的表达，进而促使ACh合成、释放增加[13]，起到抵抗AD进展、改善AD症状的作用[14]。人参皂苷Rg1可减少神经元凋亡，促进海马神经再生，提高神经可塑性，进而起到提高学习记忆能力的作用[15]。人参皂苷Rg1还可通过干扰Aβ的生成和沉积、抑制tau蛋白过度磷酸化来减少Aβ聚集，进而减轻Aβ聚集对神经元的损害[16]。此外，人参皂苷Rg1还具有提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、抗炎症反应的作用[17]。

综上所述，阿尔茨海默病模型大鼠采用人参皂苷联合骨髓间充质干细胞移植效果确切，可有效促进神经元再生，提高学习记忆能力。