3种前处理-HPLC法测定婴幼儿配方食品中维生素B1

傅红雪，陈万勤，刘柱，梁晶晶，周霞，罗金文*

浙江省食品药品检验研究院（杭州 310052）

婴幼儿配方食品中常添加维生素B1以适应婴幼儿的营养需求。维生素B1又称硫胺素，在调控新陈代谢方面有重要作用[1]，是维持心脏、神经及消化系统正常运转的必需物[2]。当人体缺乏维生素B1时，可引起多种神经炎症，患者的周围神经末梢出现发炎和退化现象，并伴有四肢麻木、肌肉萎缩、心力衰竭、下肢水肿等症状[3-4]。婴幼儿配方乳粉及谷类辅助食品是婴幼儿除母乳外的重要营养来源，因此维生素B1的添加量对婴幼儿的身体健康有着重要影响。GB 10765—2010《食品安全国家标准 婴儿配方食品》[5]中规定，婴儿配方乳中维生素B1的添加量应在14～72 μg/kJ之间；GB 10767—2010《食品安全国家标准 较大婴儿和幼儿配方食品》[6]中规定，较大婴儿和幼儿配方食品中维生素B1的添加量应≥11 μg/kJ；GB 10769—2010《食品安全国家标准 婴幼儿谷类辅助食品》[7]中规定，婴幼儿谷类辅助食品中维生素B1的添加量应≥12.5 μg/kJ。可见维生素B1含量过高或过低均会对婴幼儿产生不利影响，尤其是对一段奶粉。因此，建立婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品中维生素B1的检测方法，对维生素B1的使用监管尤为重要。

目前对维生素B1的检测主要有分光光度法[8-9]、高效液相色谱法[10-11]和液相色谱-质谱联用法[12-13]等。其中，液相色谱法是检测维生素B1常用的方法。GB 5009.84—2016《食品安全国家标准 食品中维生素B1的测定》[14]中规定了食品中维生素B1的测定方法，先将试样酸解和过夜酶解，再在碱性条件下衍生，最后利用荧光检测器检测。方法总体耗时较长，繁琐复杂，不适用于实际工作中的批量检测。何丽姗等[15]在测定婴幼儿配方乳粉中的维生素B1、B2时，将乳粉调节pH以沉淀蛋白质，过滤后直接经碱性铁氰化钾衍生，结果回收率良好。还有人在流动相中加入离子对试剂或三乙胺[16-17]，利用紫外检测器测定婴幼儿奶粉中的维生素B1，回收率良好。

分别采用国标法（GB 5009.84—2016）、酸解法和等电点法处理试样，优化提取剂和流动相配比，采用高效液相色谱-荧光检测法测定婴幼儿配方食品中的维生素B1，为婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品中维生素B1的测定提供理论基础和具体方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

维生素B1（纯度≥97.0%），中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），德国Merck公司；乙酸钠（分析纯）、盐酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、铁氰化钾（分析纯）、正丁醇（分析纯）、异丁醇（分析纯）、乙酸乙酯（分析纯）、木瓜蛋白酶（生物试剂）、淀粉酶（生物试剂），购自国药集团化学试剂有限公司；试验用水（超纯水），取自Milli-Q Reference超纯水系统。

1.2 仪器与设备

安捷伦1260型高效液相色谱仪，配备荧光检测器、安捷伦化学工作站，安捷伦科技有限公司；赛默飞世尔Multifuge X1R型高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技有限公司；默克密理博Milli-Q Reference 超纯水系统，密理博有限公司；三洋MLS-3780型高压蒸汽灭菌锅，灭菌温度105～135℃，日本三洋电机公司；梅特勒Seven Excellence型酸度计，精度0.01，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司。

1.3 试样前处理

1.3.1 国标法

称取5 g（精确至0.01 g）试样于100.0 mL锥形瓶中，加入60 mL 0.1 mol/L的盐酸溶液，摇匀后盖好瓶塞放入高压灭菌锅中，在121℃下酸解30 min。用2.0 mol/L乙酸钠溶液调节pH至4.0左右，加入2.0 mL混合酶溶液，摇匀后置于培养箱中37℃过夜（约16 h）。将酶解液全部转移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀后过滤，取上清液，备用。准确移取2.0 mL上清液于10 mL试管中，加入1.0 mL碱性铁氰化钾溶液，涡旋混匀后准确加入2.0 mL正丁醇，再次涡旋混匀1 min后以5 000 r/min离心5 min，吸取上层溶液，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤，取滤液于2 mL棕色进样瓶中，待测。

1.3.2 酸解法

称取5 g（精确至0.01 g）试样于100.0 mL锥形瓶中，加入60 mL 0.1 mol/L的盐酸溶液，摇匀后盖好瓶塞放入高压灭菌锅中，在121℃下酸解30 min，冷却至室温后取出并转移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀后过滤，取上清液，备用。准确移取2.0 mL上清液于10 mL试管中，加入1.0 mL碱性铁氰化钾溶液，涡旋混匀后准确加入2.0 mL正丁醇，再次涡旋混匀1 min后以5 000 r/min离心5 min，吸取上层溶液，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤，取滤液于2 mL棕色进样瓶中，待测。

1.3.3 等电点法

称取5 g（精确至0.01 g）试样于100.0 mL锥形瓶中，加入60 mL 50℃的水，并在50℃下振摇10 min，取出并超声10 min，冷却至室温。用2.4 mol/L盐酸溶液调节试样pH至1.7左右，放置约2 min后，再用2.5 mol/L氢氧化钠溶液调节试样pH至4.5左右。转移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度。摇匀后过滤，取上清液，备用。准确移取2.0 mL上清液于10 mL试管中，加入1.0 mL碱性铁氰化钾溶液，涡旋混匀后准确加入2.0 mL正丁醇，再次涡旋混匀1 min后以5 000 r/min离心5 min，吸取上层溶液，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤，取滤液于2 mL棕色进样瓶中，待测。

1.4 标准溶液的配制和衍生

维生素B1标准储备液：准确称取56.1 mg（精确至0.1 mg，相当于50 mg硫胺素）经五氧化二磷干燥24 h的盐酸硫胺素标准品，用0.01 mol/L盐酸溶液溶解并定容至100 mL，摇匀。置于0～4℃冰箱中保存。逐级稀释，得到质量浓度为3，30，60，150和300 ng/L的标准系列工作液。

取2.0 mL标准系列工作液，加入1.0 mL碱性铁氰化钾溶液，涡旋混匀后准确加入2.0 mL正丁醇，再次涡旋混匀1 min后以5 000 r/min离心5 min，吸取上层溶液，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤，取滤液于2 mL棕色进样瓶中，待测。

1.5 色谱条件

色谱柱：Shim-pack VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。柱温：35℃。检测器：荧光检测器。检测波长：激发波长375 nm，发射波长435 nm。进样量：15 μL。流速：1.0 mL/min。流动相：称取6.80 g乙酸钠，加水定容至1 000 mL，经0.22 μm水系微孔滤膜过滤后作为流动相A，流动相B为甲醇。流动相配比为A∶B=70∶30。

2 结果与分析

2.1 提取剂的选择

维生素B1本身并无荧光性，衍生化后需立即用强极性试剂提取出来并上样分析，因此提取剂对回收率的影响较大。分别将已知维生素B1本底含量的婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品，加入已知浓度维生素B1，采用酸解法处理试样，提取剂分别为正丁醇、异丁醇和乙酸乙酯，测定结果并计算回收率。结果见表1。由表1可得，当正丁醇作为提取剂时，婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品的回收率均最高。因此选择正丁醇作为提取剂。

表1 提取剂对回收率的影响

2.2 色谱条件的优化

GB 5009.84—2016中采用甲醇-0.05 mol/L乙酸钠（pH 4.0，35∶65，V/V）来检测维生素B1。但实际检测中发现，当甲醇比例为35%时，柱压往往过高，影响色谱柱的使用寿命。且配制流动相需调节0.05 mol/L乙酸钠溶液的pH，较为繁琐且试验过程中pH波动较大。

因此，分别采用甲醇-0.05 mol/L乙酸钠（pH 4.0，35∶65，V/V）、甲醇-0.05 mol/L乙酸钠（35∶65，V/V）、乙腈-0.05 mol/L乙酸钠（35∶65，V/V）、乙腈-0.05 mol/L乙酸钠（30∶70，V/V）、甲醇-0.05 mol/L乙酸钠（30∶70，V/V）作为流动相进行试验。结果表明，0.05 mol/L乙酸钠的加入可使维生素B1的保留时间增加，峰形得到明显改善；且未调节pH时，已经能将维生素B1与样品中的其它水溶性杂质分离开来。甲醇和乙腈对峰形影响的区别不大，考虑到甲醇较乙腈毒性更小且更经济，因此采用甲醇；但甲醇比例为35%时柱压过高，当降至30%时可明显降低柱压，且对峰形无明显影响。因此，决定采用甲醇-0.05 mol/L乙酸钠（30∶70，V/V）作为流动相。

按色谱条件对0.607 mg/L维生素B1标准溶液进行测定，其标准溶液色谱图及婴幼儿配方奶粉样品色谱图见图1和图2。

图1 维生素B1标准溶液色谱图

图2 婴幼儿配方奶粉样品色谱图

2.3 标准曲线和检出限

按色谱条件对浓度范围3.036～303.6 ng/mL之间的系列标准溶液进行测定，以仪器响应的峰面积Y对应浓度X（mg/L）进行线性回归，考察线性关系，结果见表2。由表2可得，维生素B1的相关系数R2大于0.999，表明该方法在3.036～303.6 ng/mL范围内线性关系良好。

根据3倍信噪比得出方法的检出限（3S/N），为0.008 450 mg/kg，低于GB 5009.84—2016《食品安全国家标准 食品中维生素B1的测定》中规定的检出限要求（0.3 mg/kg），完全能满足分析要求。

表2 线性参数和检出限

2.4 精密度和回收试验

分别将已知维生素B1本底含量的婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品，加入低中高三个浓度水平的维生素B1标准溶液，每个浓度平行6组，分别采用国标法、酸解法和等电点法处理试样，计算回收率及其RSD值。其中，婴幼儿配方乳粉的本底含量为3.60 mg/kg，婴幼儿谷类辅助食品的本底含量为2.57 mg/kg。结果见表3。

由表3可得，国标法处理的婴幼儿配方乳粉及谷类辅助食品的维生素B1回收率在94.4%～98.4%范围内，回收率的RSD为0.961%～1.98%（n=6）。酸解法处理的婴幼儿配方乳粉及谷类辅助食品的维生素B1回收率在96.0%～99.2%范围内，回收率的RSD为0.749%～ 1.92%（n=6）。等电点法处理的婴幼儿配方乳粉及谷类辅助食品的维生素B1回收率在95.6%～97.1%范围内，回收率的RSD为1.41%～4.20%（n=6）。3种方法的准确度和精密度良好，均满足婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品中维生素B1的测定。其中，国标法和酸解法的RSD值相对较小，等电点法的RSD值偏大。可见，国标法和酸解法优于等电点法。

2.5 样品分析

分别采用国标法、酸解法和等电点法处理试样，对市售的18种婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品进行分析，结果见表4。由表4可得，大部分的婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品都可以采用3种方法测定维生素B1。试样经国标法、酸解法处理测得维生素B1含量与标签一致。经等电点法处理测得维生素B1含量多数比国标法和酸解法高，原因考虑是国标法和酸解法均要在高温下酸解30 min，可能导致维生素B1产生变化。只有少数试样（二段奶粉1号和婴幼儿面条1号）经等电点法处理后测得维生素B1含量明显偏低。原因可能是某些婴幼儿配方乳粉或面条，在调节pH后并未能使蛋白质沉淀完全。可见，国标法和酸解法优于等电点法。酸解法相较于国标法，省去了耗时最长的酶解步骤，仍获得良好回收率。可见，酸解法前处理简单，耗时短，结果准确度高，重现性好，适用于批量检测，总体优于国标法和等电点法。

表3 精密度和回收试验结果

表4 样品分析结果

3 结论

分别采用国标法（GB 5009.84—2016）、酸解法和等电点法处理试样，并调整流动相配比，采用高效液相色谱-荧光检测法测定婴幼儿配方食品中的维生素B1，为婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品中维生素B1的测定提供理论基础和具体方法。采用正丁醇作为提取剂，提取率较高。采用甲醇-0.05 mol/L乙酸钠（30∶70）作为流动相，可增加保留时间并改善峰形。且相较于离子对试剂，甲醇-0.05 mol/L乙酸钠作为流动相对色谱柱的损害较小。3种方法的回收率和RSD（n=6）均符合要求。其中，国标法和酸解法的RSD值相对较小，等电点法的RSD值偏大。试样经国标法、酸解法处理测得维生素B1含量与标签一致，少数试样经等电点法处理后测得维生素B1含量明显偏低。酸解法相较于国标法，省去了耗时最长的酶解步骤，仍获得良好回收率。可见，酸解法前处理简单，耗时短，结果准确度高，重现性好，适用于批量检测，总体优于国标法和等电点法。

该方法可用于婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品中维生素B1的测定，从而为制定相关标准和监管措施提供技术支撑。