超声波辅助提取紫苏色素的工艺优化

徐少峰，秦磊*，吴鹏*

黄冈师范学院生物与农业资源学院，经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，大别山特色资源开发湖北省协同创新中心（黄冈 438000）

合成色素也称煤焦色素或苯胺色素。所用原料是煤焦油，对人体健康基本上是百害而无一利。有些食品已被禁止使用合成色素：诸如所有的肉及相关肉制品、鱼和海鲜、醋、酱油、腐乳等调味品。而天然色素受到了人们的关注与青睐，天然色素营养丰富，适合人体食用。目前，随着人们对于食品安全的关注，天然色素有望逐渐代替化学色素[1]。天然食用色素是从动物、植物、微生物或微生物代谢产物中提取出来的[2]，这些从食物中得到的天然色素更容易受到消费者的欢迎和喜欢，食用起来也更安全。

绝大部分植物色素没有副作用，安全性能高[3]。与其他的天然食品相比，天然色素最主要的特点是其具有抗氧化活性[4]。植物色素的颜色自然，可以增添颜色，而植物中色素含量较低，提取有限，并且对其分离纯化的技术也不成熟。大部分植物色素稳定性都较差，有些植物色素在使用过程中还须添加氧化剂、稳定剂来延长商品的货架期。同时天然色素的优点也将会开拓其在医药、日化等方面更开阔的应用领域。

紫苏（学名：Perilla frutescens（L.）Britt.），别名：桂荏、赤苏等；唇形科草本植物，可药食两用[5-6]。紫苏色素属于花青素色素。它的主要成分是紫苏素（Shisoinn）和紫苏宁（Shisolaimn）[7]。紫苏的叶、茎、果均可入药[8]，作为中药具有解毒、散寒、行气和胃的功效[9]。紫苏起源于中国，主要分布在印度、缅甸、日本、韩国、韩国、印度尼西亚和俄罗斯等国家[10]。紫苏在美国、日本、加拿大、俄罗斯等国家作为一种美食，主要被用于寿司、配菜和汤中[11]。紫苏有特异芳香，适应性很强，容易栽培。

蔡宁晨[12]在对紫苏叶花色苷的提取分析及其功能的研究中，通过抑菌试验发现：紫苏叶花色苷在预防和治疗由细菌引起的疾病方面有一定潜能。由吴周和等[13]对紫苏色素的提取及其热稳定性研究分析可知，在吸收光谱中，530 nm处有最大吸收峰，主要成分是紫苏花色素苷，使提取液呈红色。另外在420 nm处也出现了一较大的吸收峰，据推测，其成分可能是叶绿素及黄酮类化合物，可通过旋转蒸发仪将叶绿素等尽可能蒸出，最后得到紫苏色素的紫红色浓缩液，再测其吸光度发现420 nm处没有吸收峰。

随着功能性食品添加剂市场的扩张，天然食用色素将会以保健品的形式添加出现，天然植物色素最大的缺点就是稳定性很差，提取后颜色易变化，而我国植物色素的有些生产厂家技术落后，设备简陋，产品质量稳定性更差[14]。由苑玉莉等[15]对紫苏中花色素的提取及储藏稳定性的研究得出，紫苏花色素苷的储藏条件是冷冻、避光、隔氧。

而且徐建越[17]对紫苏色素的提取及理化性质的研究发现，升高提取温度、延长提取时间可提高提取率。紫苏色素色调变化大，稳定性差。紫苏色素对低热（＜60℃）较稳定，对高热（＞80℃）稳定性较差[16]。紫苏色素在各种介质中热稳定性大小的排列顺序为：柠檬酸＞淀粉＞蔗糖=CaCl2＞NaCI＞苯钾酸钠＞VC。故而可以应用于酸性饮料、水果制品、乳酸饮料等中[17]。长时间的光照也会对紫苏叶花色苷造成影响，随着光照时间的增长，紫苏叶花色苷的色彩密度和聚合色素都有一定程度的降低。由陈勇等[18]对不同pH条件下紫苏色素降解动力学的研究发现：对于不同的pH而言，紫苏色素热降解反应随着pH的增大而加快。故酸性环境有利于减少紫苏色素的降解。

刘玉萍[19]通过离心过滤的方法提取紫苏色素得出了紫苏色素在可见光范围内的最大吸收峰为360 nm，由L16(45)正交试验确定了影响色素提取效果的最主要因素是料液比。并得出紫苏色素提取的最佳工艺条件：超声波频率为中频（47.6 kHz），提取溶剂为55%乙醇，提取时间15 min，提取温度60℃，料液比1∶15（g/mL）。吴周和等[13]以酸性甲醇为提取溶剂，得出了料液比对提取率影响最为显著。紫苏叶色素的最佳提取工艺条件为：提取剂为1% HCl-甲醇溶液，提取温度为50℃，提取时间为3 h，料液比为1∶15（g/mL）[20]。由前人的试验结果可以看到，大家所得的结果不尽相同，当然这也可能是仪器误差、温度误差、操作误差等的存在以及所选择的试剂不同所造成的。

超声波辅助提取是利用超声场的方法从天然产物中提取活性成分。其原理是在存在于物质中的微气核空化核在超声场的作用下产生振动、生长和崩溃的过程，即超声空化效应，从而产生局部的高温高压，增强物质在溶剂中的溶解能力[21]。

试验通过超声波辅助提供一种优化紫苏色素提取效果的工艺方案，采用单因素试验和正交试验分析得到最佳提取工艺条件，进而为实现紫苏色素提取的工业扩大化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫苏叶经烘干粉碎后备用；无水乙醇（分析纯）；蒸馏水（实验室自制）。

1.2 仪器与设备

DFT-200C 200克手提式万能高速粉碎机，上海比朗仪器有限公司；YP1201N电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；KQ-500DB型数控超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；SP-723型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；

1.3 方法

1.3.1 确定最大吸收波长

称取已备好的紫苏粉末0.200 0 g为一份的用量，以料液比1∶30（g/mL）加入提取溶剂无水乙醇6 mL，在超声功率240 W下，超声9 min后将所得液体在真空泵的作用下抽滤，再加入蒸馏水在100 mL的容量瓶中定容，通过紫外可见分光光度计在400～600 nm进行全波段扫描，测得最大吸收波长为415 nm。

1.3.2 超声波辅助提取紫苏色素的单因素试验

主要考虑以下三个因素对提取效果的影响：超声的时间，超声的功率，料液比。

超声时间对提取紫苏色素的影响：称取紫苏粉末0.200 0 g五份，以料液比1∶30（g/mL）加入提取溶剂无水乙醇6 mL，在超声功率240 W下，由不同的超声时间（6，12，18，24和30 min），将所得液体在真空泵的作用下抽滤，再加入蒸馏水在100 mL的容量瓶中定容，使用紫外可见分光光度计检测它们在415 nm处的吸光度。

超声功率对提取紫苏色素的影响：称取紫苏粉末0.200 0 g五份，以料液比1∶30（g/mL）都加入提取溶剂无水乙醇6 mL，由不同的超声功率（180，240，300，360和420 W），超声9 min后将所得液体在真空泵的作用下抽滤，再加入蒸馏水在100 mL的容量瓶中定容，使用紫外可见分光光度计检测它们在415 nm处的吸光度。

料液比对提取紫苏色素的影响：称取紫苏粉末0.200 0 g五份，由不同的料液比（1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60（g/mL））分别加入对应量的提取溶剂无水乙醇，在超声功率240 W下，超声9 min后将所得液体在真空泵的作用下抽滤，再加入蒸馏水在100 mL的容量瓶中定容，用紫外可见分光光度计检测它们在415 nm处的吸光度。

1.3.3 正交试验确定最佳提取工艺

超声时间、超声功率、料液比对紫苏色素的提取效果都有或多或少的影响。通过正交试验分析这3个因素在3水平上对紫苏色素提取效果的影响大小及最优值，设计如表1所示。

表1 因素水平表

2 结果与分析

2.1 单因素对提取效果的影响

2.1.1 超声时间对紫苏色素提取效果的影响

试验结果见图1。紫苏色素提取的吸光度随超声时间的增大而增大。但到了24 min之后，紫苏色素提取的吸光度提高变缓，应该是比较接近最佳时间了，在五组试验中30 min为最佳提取时间。关键是紫苏色素确实极不稳定，所以没有接着继续进行后续试验。

2.1.2 超声功率对紫苏色素提取效果的影响

试验结果见图2，紫苏色素提取液的吸光度在超声功率为360 W之前呈增长态势，这是因为随着超声功率的提高，紫苏色素在提取溶剂中的传质速率加快，溶解速度也加快，体现了超声波在破坏细胞壁结构来促使细胞内成分溶出的高效性，所以紫苏色素提取的效果提高。超声功率超过360 W之后吸光度就下降了，是因为超声功率太大了，紫苏色素的结构可能被破坏，使其含量下降。说明在超声功率360 W时紫苏色素的提取吸光度最大。故选择360 W为最佳提取超声功率。

图1 超声时间对提取效果的影响

图2 超声功率对提取效果的影响

2.1.3 料液比对紫苏色素提取效果的影响

试验结果见图3，开始吸光度随料液比的增大而增大，这是因为料液比增大，提取溶剂用量增大，紫苏色素溶解量就增大。紫苏色素的提取吸光度在料液比为1∶50（g/mL）时有最大值，之后又呈下降趋势，是因为溶剂过大了，紫苏色素提取溶剂中的传质速率减小从而使其溶解量减小，导致提取效果的下降，同时，溶剂用量太大也会造成浪费。故选择1∶50（g/mL）为最佳提取料液比。

图3 料液比对提取效果的影响

2.2 正交试验结果及分析

A、B、C分别表示超声时间、超声功率、料液比这三个因素，D表示空白，经过正交试验得出的结果如表2所示，方差分析如表3所示。

由表3可得，影响紫苏色素提取效果的因素的主次顺序是A＞B=C，即超声时间＞料液比=超声功率，超声时间对紫苏色素提取效果影响最大，料液比和超声功率的影响一样。其最优组合是A3B3C3，故超声波辅助提取紫苏色素的最佳工艺条件是超声时间为30 min，料液比为1∶60（g/mL），超声功率为420 W。

表2 正交试验结果表

表3 方差分析表

3 讨论与结论

试验中发现紫苏色素不稳定，放置后提取溶液会由偏暗橙黄色变为黄绿色。将提取液抽滤，用旋转蒸发仪浓缩至略带黏稠状的深红色液体，即得到紫苏色素样品。在真空浓缩的后期，出现深黄绿色的凝块，可能是叶绿素析出[13]。试验得到的紫苏色素为黄绿色，比较透亮，另一方面可能是其中还有未分离出来的叶绿素的缘故。由蔡宁晨[12]的研究发现，当处于酸性条件尤其是pH为2～4的环境中，紫苏叶花色苷是比较稳定的。pH≥7时，紫苏叶花色苷会被分解为其他物质，呈浅黄色。

试验结果分析中，方差分析表里没能得到显著性，可能是因为研究的影响因素有限，只是研究了三个因素的影响。食品的色泽是食品的一项重要感官指标，要想真正用上天然色素，并且广泛多领域使用，就急需研制护色剂或制定出良好的护色方案。

正交优化所得的超声波辅助提取紫苏色素的最佳提取工艺条件为：超声时间30 min，料液比1∶60（g/mL），超声功率420 W。紫苏资源丰富又分布广泛，是提取天然色素的较佳原料，为紫苏色素提取的工业化提供了理论基础。