豆浆灌根对烤烟生长及土壤细菌群落的影响

戴华鑫，张艳玲，段卫东，陈小龙，苏新宏，任应斌，刘文涛，李 亮，毛家伟，张 翔*

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

2.河南中烟工业有限责任公司，郑州市榆林南路16 号 450000

3.河南省烟草公司三门峡市公司，河南省三门峡市崤山路中段 472000

4.郑州大学化工与能源学院，郑州市科学大道100 号 450001

5.河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所，郑州市花园路116 号 450002

豆浆灌根是河南三门峡烟区经过长期生产实践形成的一种成熟有效的有机肥追施技术，常年推广面积占本地烤烟种植总面积的90%以上。近年来在洛阳、平顶山、南阳等烟区逐步推广。传统豆浆灌根技术包括豆浆制作和田间施用两部分，将大豆用水浸泡，待大豆发胀后用机器打碎，再密封保存，于太阳下暴晒1 周，充分发酵至发臭，最后根据土壤墒情兑水混匀，浇灌于烟株根部［1］。目前，与传统豆浆制作方法相比，通过工厂自动化加工生产的酵解豆粕营养丰富、品质稳定，在提高烤烟品质方面取得较好的应用效果［2］。

土壤微生物参与土壤的形成发育、物质循环和肥力演变等过程，是维持土壤质量的重要组成部分［3］。土壤微生物是土壤生态系统中物质循环和能量流动的主要参与者，具有土壤C、N、P 和S循环的“推进器”和土壤养分植物有效性的“转换器”等多方面功能，其代谢物是植物体所需的营养成分；土壤微生物种群多样性及优势菌属的变化，可在一定程度上反映土壤质量的优劣［4-5］。前人研究发现，传统豆浆灌根可提高烤烟物理、化学、外观和感官品质［2］，提高烟叶香气物质总量［6］，配施其他有机肥能促进烤烟生长发育［7］，提高烤烟感官品质和烟株抗病性［8］。目前，关于豆浆灌根对烤烟的影响研究多集中于提升烤烟质量方面，而豆浆灌根对土壤养分、土壤微生物菌落结构的系统研究较少，尤其是豆浆灌根对土壤细菌数量、群落结构及功能细菌丰度的影响方面尚未见报道。因此，通过盆栽和大田试验，检测豆浆灌根前后土壤养分、烟株农艺性状和根系生长的变化，明确豆浆灌根对土壤细菌数量、群落结构及功能细菌的影响，以揭示其促进烤烟生长和提高烟叶品质的机理，为豆浆灌根这一土壤保育措施的推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

1.1.1 大田试验

于2017 年在河南省三门峡市卢氏县杜关镇选择土壤肥力中等水平的平整地块，以当地主栽品种云烟87 为材料，开展豆浆灌根田间试验。传统豆浆与酵解豆粕的营养成分见表1。烟苗5 月2 日移栽，种植密度及田间管理按照当地优质烟叶生产技术规范进行，试验小区的栽培条件一致。烟苗移栽28 d 后进行豆浆灌根，设置3 个处理：分别为清水对照（CK）、传统豆浆（T1）和酵解豆粕（T2）；传统豆浆和酵解豆粕的灌根用量均为5 kg/667m2，具体施用方法参考文献［1］。豆浆灌根后0、5、20、35、55、75 和95 d 采集大田土壤样品。采用多点混合取样法采集烟株间垄体0～15 cm 处的土壤，采集10 棵烟株根围土壤混合成1 个样品，每处理采集3 个混合样品。将采集的土壤样品分为两部分，一部分立即用无菌封口袋包扎密封，置于干冰中带回至实验室于-80℃冰箱中保存，用于土壤DNA 的提取；另一部分装入布袋，室内自然风干，过2 mm 筛后用于土壤有机质、速效氮、有效磷、速效钾、有效铁、交换性钙、交换性镁、活性有机碳及土壤蛋白等养分指标的测定。烟株打顶前测定株高、节距、茎围、留叶数、最大叶长和叶宽等农艺性状指标，每处理15 次重复。

1.1.2 盆栽试验

采集河南省三门峡市卢氏县大田试验用的烟田土壤，充分混匀过筛后去除石块等杂质，装入40 L 塑料盆中。选取六叶一心生长期的云烟87 烟苗，于5 月2 日前移栽，每处理10 盆，每盆3 株，移栽28 d 后进行间苗处理，保留1 株，处理设置同大田试验。豆浆灌根处理40 d 后，用自来水冲洗烟株根系，待根系上土壤全部被冲掉后，置于WinRHIZO PRO 根系扫描系统（加拿大Regent 公司）中测定根系生长指标，最后放入55 ℃烘箱中烘干称量。

表1 传统豆浆与酵解豆粕的营养成分比较Tab.1 Nutrient compositions of traditional soymilk and fermented soymeal （g/kg）

1.2 测定方法

1.2.1 土壤养分含量的测定

采用碱解扩散法测定土壤碱解氮含量（质量分数）［9］；采用NaHCO3浸提—钼蓝比色法测定有效磷含量［9］；采用NH4OAc 浸提—火焰光度法测定速效钾含量［9］；采用重铬酸钾容量法测定土壤有机质含量［9］；采用二乙三胺五乙酸浸提—原子吸收分光光度法测定有效态铁、交换性钙和镁含量［9］。参照康奈尔土壤健康评价中的试验方法测定土壤蛋白和活性有机碳含量［9］。

1.2.2 土壤细菌多样性与数量检测

采用土壤DNA 专用提取试剂盒（PowerSoil DNA Isolation Kit，美国MO BIO Laboratories 公司）提取土壤微生物基因组DNA，将获得的DNA 样品置于-20℃冰箱中保存备用。

PCR反应引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCG GTAA-3′）和926R（5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTT T-3′）。利用胶回收试剂盒（美国Axygen 公司）回收PCR 产物，获得PCR 扩增目的片段，并连接pMD18-T 载体（日本Takara 公司），转化感受态细胞，进行PCR 菌落鉴定，对阳性克隆进行测序。根据测序结果，利用质粒提取试剂盒（美国Axygen公司）提取含有目的片段的质粒作为标准质粒，利用Qubit 3.0（美国Invitrogen 公司）测定质粒DNA溶液浓度，并计算标准质粒的拷贝数。通过荧光定量PCR 构建标准曲线。采用FTC-3000TM Real-Time qPCR 系统（上海Funglyn Biotech 公司）定量PCR 仪，SRBR Premix Ex TaqTM（2×）（日本Takara 公司）进行定量分析，结果以目标微生物拷贝数表示。

1.2.3 细菌16S rDNA 序列扩增和MiSeq 测序

选取16S rDNA 的V4～V5 区序列进行高通量测序分析，采用两步PCR 扩增方法进行文库构建，MiSeq 测序及序列优化具体步骤参照文献［10］。

1.3 数据分析

采用97%相似性进行OTU（operational taxonomic unit）聚 类（UPARSE software），OTU 代表序列与SILVA 128 数据库比对进行物种信息注释。基于分类学信息，在门、纲、目、科、属分类水平上进行群落结构的统计分析。利用mothur（Version 1.33.3）进行Chao 物种丰富度和Shannon物种多样性分析。利用SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析，采用Duncan's 新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 豆浆灌根对大田土壤养分含量的影响

由表2 可知，豆浆（传统豆浆和酵解豆粕）灌根前，不同处理间各营养元素含量无显著差异。豆浆灌根初期（5 d），清水处理后的活性有机碳、土壤蛋白含量低于豆浆灌根处理。灌根后20 d，酵解豆粕处理的土壤速效氮、有效磷、速效钾含量显著高于对照和传统豆浆处理，交换性钙和交换性镁含量显著高于对照；豆浆灌根后55、75 和95 d，土壤中的速效氮和有效磷含量显著高于对照；豆浆灌根后75 d 和95 d，土壤速效钾含量显著高于对照。而豆浆灌根对土壤有机质和有效铁含量无显著影响。与对照相比，土壤蛋白和活性有机碳含量在豆浆灌根后5 d 和20 d 均显著升高；在传统豆浆灌根后35 d 土壤蛋白仍保持较高含量，35 d之后处理间含量无明显差异。

2.2 豆浆灌根对大田烤烟农艺性状的影响

由表3 可知，豆浆灌根对大田烤烟株高、节距、茎围、留叶数、中部叶最大叶宽、上部叶最大叶长等生长指标的影响不大，但传统豆浆和酵解豆粕处理后中部叶最大叶长分别显著高于对照1.9 cm和2.1 cm，上部叶最大叶宽显著高于对照1.6 cm和1.7 cm。因此，豆浆灌根能促进大田烤烟叶片的生长。

2.3 豆浆灌根对盆栽烤烟生长的影响

由表4 可知，与对照相比，豆浆灌根后的盆栽烟株总根长、根表面积、根直径、单位体积根长、根体积、根干质量等指标均显著提高。与对照相比，传统豆浆和酵解豆粕处理后总根长分别提高16.6%和12.8%，根表面积分别提高21.1%和25.1%，根直径分别提高15.0%和17.4%，单位体积根长分别提高16.8%和13.1%，根体积分别提高27.7%和29.5%，根干质量分别提高16.6%和17.6%。

表2 豆浆灌根对土壤养分含量的影响①Tab.2 Effects of root irrigation with soymilk on soil nutrient contents （mg/kg）

表3 豆浆灌根对大田烤烟农艺性状的影响Tab.3 Effects of root irrigation with soymilk on agronomic traits of flue-cured tobacco in fields

表4 豆浆灌根对盆栽烤烟根系生长的影响Tab.4 Effects of root irrigation with soymilk on root growth of potted flue-cured tobacco

由表5 可知，与对照相比，豆浆灌根后盆栽烟株的株高和茎围无明显变化，烟株留叶数显著增加；传统豆浆和酵解豆粕处理后，烟株中部叶及上部叶叶长和叶宽均显著增加，其中，中部叶最大叶长分别增加2.9 cm 和2.6 cm，叶宽分别增加1.8cm和1.5cm；上部叶最大叶长分别增加2.9 cm 和3.0 cm，叶宽分别增加1.6 cm 和2.1 cm。综合来看，豆浆灌根能显著促进烤烟根系及地上部叶片的生长发育。

表5 豆浆灌根对盆栽烤烟地上部生长的影响Tab.5 Effects of root irrigation with soymilk on aerial parts of potted flue-cured tobacco

2.4 豆浆灌根对大田土壤细菌数量的影响

由图1 可知，豆浆灌根前土壤中细菌数量差异不大；传统豆浆处理后5 d 和20 d 细菌数量呈上升趋势，分别为5.59×108cfu·g-1和11.61×108cfu·g-1。酵解豆粕处理后5 d 土壤中细菌数量达到最大值，为9.34×108cfu·g-1，是对照的7.7 倍；豆浆灌根处理后35 d 至95 d 土壤细菌数量呈波动变化，但显著低于灌根初期；清水对照处理的细菌数量变化不大。

图1 豆浆灌根对土壤细菌数量的影响Fig.1 Effects of root irrigation with soymilk on number of soil bacteria

2.5 豆浆灌根对土壤细菌多样性的影响

由表6 看出，各样品OTU 数目分布在1 107～2 132 之间，序列覆盖率均达到0.98 以上，说明各样品文库中包含了细菌群落的绝大多数细菌类群，基本能反映群落结构组成。传统豆浆和酵解豆粕处理后5 d 和20 d，细菌OTU 数量显著下降，表明豆浆（尤其是酵解豆粕）处理短时间内能明显改变土壤的微生态环境。豆浆灌根后35 d 和55 d，酵解豆粕细菌OTU 数量低于对照；豆浆灌根后75 d细菌OTU 数量显著高于对照；豆浆灌根后95 d，3个处理间细菌OTU 数量无显著差异。

由图2 可知，豆浆灌根后5 d，酵解豆粕处理的Chao 和Shannon 数值显著低于对照和传统豆浆。豆浆灌根后35 d 和95 d，3 种处理间土壤细菌Chao 和Shannon 指数无显著变化。酵解豆粕处理后35 d 和95 d，Chao 和Shannon 指数无显著变化。

2.6 豆浆灌根对大田土壤细菌（门水平）群落结构的影响

豆浆灌根不同时间点土壤细菌门水平的相对丰度见图3。样品中含量大于1%的细菌类群共有13 个，分别为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌 门 （Gemmatimonadetes） 、浮 霉 菌 门（Planctomycetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、蓝细菌（Cyanobacteria）、栖热菌 门（Deinococcus-Thermus）、疣 微 菌 门（Verrucomicrobia）、装甲菌门（Armatimonadetes）。

表6 豆浆灌根对土壤细菌OTUs 的影响Tab.6 Effects of root irrigation with soymilk on soil bacteria OTUs

豆浆灌根初期（5 d），不同处理间土壤优势菌门丰度差异明显。豆浆灌根初期，土壤变形菌门和拟杆菌门相对丰度上升明显，放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、浮霉菌门和硝化螺旋菌门所占比例下降显著，表明豆浆灌根短期内可明显改变土壤的细菌群落结构；传统豆浆和酵解豆粕处理对土壤细菌群落的影响也有差异，与对照相比，传统豆浆施用后放线菌门所占比例显著下降，酵解豆粕施用后的芽单胞菌门和装甲菌门所占比例下降明显，而厚壁菌门所占比例有所上升，这可能是由于传统豆浆与酵解豆粕自身性质不同造成的。豆浆灌根后中后期（35 d 和95 d），不同处理间主要的13 种细菌门类的相对丰度无显著差异。

图2 豆浆灌根后5 d（A、D）、35 d（B、E）和95 d（C、F）土壤细菌Chao 和Shannon 指数比较Fig.2 Comparison of Chao and Shannon indices of soil bacteria on the 5th(A,D),35th(B,E)and 95th(C,F)days after root irrigation with soymilk

图3 豆浆灌根后5 d（A）、35 d（B）和95 d（C）土壤细菌门水平群落分布相对丰度比较Fig.3 Abundances of bacterial communities at phylum level in tobacco-planting soil on the 5th(A),35th(B)and 95th(C)days after root irrigation with soymilk

2.7 豆浆灌根对大田土壤功能性细菌属相对丰度的影响

由表7 看出，土壤中不同细菌属在豆浆灌根前后表现差异较大，如链霉菌属和克雷白氏杆菌属在酵解豆粕处理后的丰度分别为6.23%和3.53%，显著高于传统豆浆处理（1.59%和0.04%）和对照（2.78%和0.01%）；鞘脂单胞菌属在传统豆浆处理后的丰度（1.39%）显著高于酵解豆粕处理（0.33%）和对照（0.20%）；产黄杆菌属、Massilia、噬几丁质菌属、鞘氨醇杆菌属等在豆浆灌根后的丰度均显著增加；除硝化细菌属和芽单胞菌属外，其他参与养分循环的细菌属丰度均低于传统豆浆或酵解豆粕处理。芽孢杆菌属、假单胞菌属、Pseudoduganella 和藤黄色杆菌属等4 种细菌为植物 根 际 促 生 菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR 菌），其主要功能是分泌植物生长调节剂而促进植物生长。与对照相比，4 种细菌属在对照中的丰度均显著低于传统豆浆和酵解豆粕处理。豆浆灌根后，溶杆菌属、假黄单胞菌属、分枝杆菌属和蛭弧菌属等拮抗微生物的丰度均高于对照，可通过溶菌作用或产生抗生素类物质等方式对土传病原菌产生拮抗作用。豆浆灌根处理后致病菌Aquicella 的相对丰度下降50%。

表7 豆浆灌根初期土壤中功能细菌的丰度变化Tab.7 Changes in abundances of soil bacteria at early stage of root irrigation with soymilk （%）

3 讨论

3.1 豆浆灌根条件下植烟土壤细菌数量和群落结构的变化

细菌是土壤中的主要微生物类群，在土壤的物质循环转化中发挥着重要作用。土壤细菌的数量、多样性和群落结构与植物生长及病害防治密切相关［11-12］。研究发现，施用芝麻饼肥可明显改善烤烟根际微生物区系，显著提高各类微生物数量［13］。秸秆还田和腐熟有机肥对提高土壤微生物数量有明显作用，对植烟土壤细菌群落多样性无显著影响［14］，与本试验中豆浆灌根后土壤细菌数量大幅度提高，灌根中后期细菌多样性指数与对照相比无显著差异的研究结果一致。这可能是由于传统豆浆和酵解豆粕施入土壤后，增加了土壤活性有机碳和土壤蛋白含量，为细菌快速繁殖提供了新的能源和营养源，而未改变土壤细菌的多样性指数。本研究中各处理土壤的优势菌群均为变形菌门、放线菌门、拟杆菌门等13 个优势菌群，但其所占比例有较大差异，这与前人的研究结果一致［15］。变形菌门被认为是土壤中最常见的菌门［16］，与土壤中碳的利用有关［17］；酸杆菌在土壤中分布广泛，多存活于贫瘠的土壤环境中［18-19］，其丰富度与碳可用性呈负相关［17］。因此，变形菌门和酸杆菌门可用作土壤养分状况的指示菌［20］。放线菌是产生抗生素的主要细菌，土壤中放线菌数量及拮抗放线菌的比例，对调整土壤微生物生态平衡有至关重要作用［21］。本研究中豆浆灌根后，土壤中变形菌门相对丰度提高明显，酸杆菌门所占比例下降显著，表明豆浆灌根处理可能提高了土壤碳源的可利用性，这也与检测到的土壤活性有机碳含量增加的试验结果一致；其次，传统豆浆灌根后放线菌门所占比例显著下降，可能是因为传统豆浆中存在有抑制放线菌门的抗菌物质所致。

土壤微生物可对土壤的微小变化作出敏感反应，其群落结构在很大程度上决定了土壤的生物活性，因此被认为是土壤生态系统变化的预警指标［22-23］。土壤特异微生物主要包括生理类群微生物、拮抗微生物、病原微生物等［24］；对植物的积极作用主要有参与养分循环、抑制病原菌以及分泌植物生长调节剂等，消极作用主要是产生病害［25-26］。微生物生理类群在土壤生态中发挥重要作用，如硝化螺菌属、固氮菌、鞘脂单胞菌属、假单胞菌属、鞘氨醇杆菌属等在物质转化中具有特定的功能，其分布特征和数量通常与土壤碳氮循环密切相关，直接影响土壤肥力［27］。本试验中豆浆灌根初期，除硝化螺菌属和芽单胞菌属在对照中的丰度高于传统豆浆和酵解豆粕处理外，多种细菌如链霉菌属、产黄杆菌属、水恒杆菌属、克雷白氏杆菌、鞘脂单胞菌属、链霉菌属、Massilia、鞘氨醇杆菌属、噬胞菌属、纤维弧菌属等在土壤中的相对丰度均有显著提高，这些功能细菌在根际周围发挥了固氮、解磷、解钾、矿化复杂有机物、降解有机物以及分泌生长激素促进根系生长的作用，说明豆浆灌根能促进植烟土壤中有益生理类群微生物的繁殖，进而影响土壤肥力［28-29］。

植物根际促生菌对土壤有害病原微生物与非寄生性根际有害微生物都有生防作用，可促进植物对矿质营养的吸收和利用，并可产生有益于植物生长的代谢产物（如生长素），进而促进植物的生长发育［30］。有报道认为，芽孢杆菌属和假单胞菌属是土壤中分布较多的根际促生菌之一［31］，Pseudoduganella 是健康土壤中的标志细菌之一［32］，藤黄色杆菌属能促进植物根系生长［33］。本研究中发现，传统豆浆及酵解豆粕施用后，芽孢杆菌、假单胞菌属丰度显著提高，说明豆浆灌根有利于烟株根系吸收矿质营养。

溶杆菌属、假黄单胞菌属、分枝杆菌和蛭弧菌属等作为生防细菌，具有溶菌作用，可拮抗多种植物病害［34］，Aquicella 是连作土壤中的土传病原菌之一［20］。豆浆灌根后4 种生防细菌属的丰度均高于对照，而致病菌Aquicella 丰度低于对照，说明豆浆灌根能提高根际土壤拮抗微生物的丰度，降低致病菌含量，有利于土壤根际周围形成健康微生物群落结构，促进烤烟根系生长发育。

3.2 豆浆灌根条件下植烟土壤养分和烤烟生长的变化

大田土壤中的氮素及中微量微量元素可通过施肥补充，一旦补充量不足或补充时间错位，土壤养分易出现亏损，致使农作物生长不良，严重时甚至造成大幅减产［35］。传统豆浆和酵解豆粕中有机质含量高，且含有一定量的氮、磷、钾及中微量元素。在烤烟由团棵期转至旺长期的关键阶段，豆浆灌根在补充土壤水分的同时，可作为土壤养分元素的重要补充途径。有研究表明，秸秆还田和腐熟有机肥可提高植烟土壤的速效钾、有机碳、有效镁等养分含量［14］；复方有机菌肥可显著提高土壤碱解氮含量，与化肥和芝麻饼肥配施可明显提高土壤肥力水平［36］。生物有机肥不仅能显著提高土壤有机碳、速效磷和速效钾含量，同时可提高土壤微生物的功能多样性［37］。混合有机肥、汽爆玉米秸秆和草炭等有机物料可明显提高土壤活性有机碳含量和碳库活度，改善烟株根际土壤环境［38-39］。本试验中传统豆浆和酵解豆粕处理后，土壤活性有机碳和土壤蛋白在豆浆灌根初期上升明显。活性有机碳和土壤蛋白作为土壤中微生物的主要碳源和氮源，可促进烟株根系周围形成更加健康的土壤微生态环境，促进烟草根系生长发育，这可能是豆浆灌根促进烤烟根系生长的主要原因之一。总体来看，豆浆灌根初期参与土壤养分循环、抑制病原菌、分泌植物生长调节剂及抑制病原菌等功能细菌的丰度显著提高，伴随土壤活性有机碳和土壤蛋白含量显著升高，烟株根系生长健壮；豆浆灌根中后期土壤速效氮、有效磷、速效钾等养分含量保持较高水平，并一直持续到烤烟成熟期，这可能是烟株中上部叶片长宽增加的主要原因。

4 结论

豆浆灌根初期土壤蛋白和活性有机碳含量显著提高，中后期土壤碱解氮、有效磷和速效钾等养分保持较高含量水平。豆浆灌根可促进烤烟根系和地上部烟叶生长，豆浆灌根初期土壤中多个优势菌门丰度差异明显，参与养分循环、分泌植物生长调节剂、抑制病原菌等功能细菌丰度明显升高。因此，豆浆灌根可提高土壤养分含量，提升功能细菌的相对丰度，改善土壤微生态环境，促进烤烟根系和叶片生长发育。