和厚朴酚体外抗氧化活性的研究

王 锋，麻旭州，王道才，赵黎明，刘晓鹏，*

(1.湖北民族大学 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；2.生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族大学)，湖北 恩施 445000)

机体在正常的生命活动过程中一直伴随着有氧代谢，不断地产生自由基，自由基具有极强的生物活性且十分不稳定，是多种疾病的根源[1].正常情况下，机体内自由基处于一个动态平衡状态；但如果自由基产生过快或清除过慢，它们就会对机体造成伤害，甚至会诱发诸多疾病，例如癌症、类风湿性关节炎、心血管疾病、糖尿病以及与衰老相关的退行性过程[2-5].抗氧化剂能够有效地清除自由基，使机体免受自由基的损伤，受到广泛应用.目前所使用的抗氧化剂多是人工合成，但是人工合成的氧化剂摄入过多会产生毒副作用，其安全性与健康的初衷相反[6].天然抗氧化剂由于对机体的安全性高、无副作用且自身抗氧化能力强等特点愈来愈受到重视[7]，因此从植物中研究提取天然抗氧化剂具有重要意义.

和厚朴酚是木兰科植物厚朴(MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.)和凹叶厚朴(MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.)的干燥干皮、根皮及枝皮中的主要药效成分之一[8-9]，具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗氧化、抗抑郁、抗病毒、调节免疫和保护神经系统等作用[10-14].尽管酚类物质具有抗氧化活性，但迄今并未有研究明确和厚朴酚的体外抗氧化活性的强弱[15].本研究选取ABTS+·与DPPH自由基清除能力、FRAP值、总还原力和Fe2+螯合力5个指标，并以Vc当量以及EDTA-2Na当量为单位，较系统地探究了和厚朴酚的体外抗氧化力，明确了其抗氧化活性能力的强弱，为和厚朴酚开发成一种新型的抗氧化剂提供试验依据.

图1 和厚朴酚与Vc的ABTS+·清除力Fig.1 ABTS+· scavenging ability of honokiol and Vc

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

和厚朴酚(Honokiol)购自西安天宝生物科技有限公司(纯度>99%)；L(+)-抗坏血酸(Vc)、EDTA-2Na购自国药集团化学试剂有限公司；ABTS购自life science products & senies；DPPH购自东京化成工业株式会社；2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ)购自日本东京化成工业株式会社；六氰合铁酸钾购自天津市光复科技有限公司；菲咯嗪(3-(2-Pyridyl)-5,6-bis-(4-phenylsulfonicacid)-1,2,4-triazine)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；以上及其余试剂均为分析纯.

1.2 方法

1.2.1 ABTS+·清除力的测定 参照文献[16]的方法，略有改动.先测定计算Vc标准品的ABTS+·清除率P，以Vc摩尔浓度为自变量、ABTS+·清除率为因变量绘制标准曲线并计算回归方程；然后测定计算和厚朴酚的ABTS+·清除率P，以和厚朴酚摩尔浓度为自变量、ABTS+·清除率为因变量绘制标准曲线并计算回归方程，计算和厚朴酚的Vc当量.

1.2.2 DPPH自由基清除力的测定 参照文献[17]的方法，略有改动.先测定计算Vc标准品的DPPH自由基清除率P，以Vc摩尔浓度为自变量、DPPH自由基清除率为因变量绘制标准曲线并计算回归方程；然后测定计算和厚朴酚的DPPH自由基清除率P，以和厚朴酚摩尔浓度为自变量、DPPH自由基清除率为因变量绘制标准曲线并计算回归方程，计算和厚朴酚DPPH自由基清除力的Vc当量.

1.2.3 铁离子还原抗氧化能力的测定 参照文献[18]的方法，略有改动.先测定计算Vc标准品的铁离子还原抗氧化能力，以Vc摩尔浓度为自变量、593 nm处吸光值为因变量绘制标准曲线并计算回归方程；然后测定计算和厚朴酚的铁离子还原抗氧化能力，以和厚朴酚摩尔浓度为自变量、593 nm处吸光值为因变量绘制标准曲线并计算回归方程，计算和厚朴酚铁离子还原抗氧化能力的Vc当量.

1.2.4 总还原力的测定 参照文献[19]的方法，略有改动.先测定计算Vc标准品的总还原力；以Vc摩尔浓度为自变量、700 nm处的吸光值为因变量绘制标准曲线并计算回归方程；然后测定计算和厚朴酚的总还原力，以和厚朴酚摩尔浓度为自变量、700 nm处的吸光值为因变量绘制标准曲线并得出回归方程，计算和厚朴酚总还原力的Vc当量.

1.2.5 亚铁离子螯合能力的测定 参照文献[20]的方法，略有改动.先测定计算EDTA-2Na标准品的亚铁离子螯合率(清除率)P，以标准品摩尔浓度为自变量、亚铁离子螯合率为因变量绘制标准曲线并计算回归方程；然后测定计算和厚朴酚的亚铁离子螯合率(清除率)P，以和厚朴酚摩尔浓度为自变量、亚铁离子螯合率为因变量绘制标准曲线并得出回归方程，计算和厚朴酚亚铁离子螯合能力的EDTA-2Na当量.

1.2.6 数据处理 采用SPSS 17.0软件分析数据，数据以均数±标准误(Mean±SE)表示.

2 结果与分析

2.1 和厚朴酚的ABTS+·清除力

和厚朴酚具有很强的ABTS+·清除力，和厚朴酚在0～0.047 mmol/L(0～0.0125 mg/mL)范围内，其ABTS+·清除力与其摩尔浓度呈正相关，线性方程为y=1 069.8x+0.894，决定系数R2=0.998 3(图1)；Vc在0～0.142 mmol/L(0～0.025 mg/mL)范围内，Vc摩尔浓度与ABTS+·清除率之间有良好的线性关系，线性方程为y=444.144x-2.214，决定系数R2=0.996 5(图1).计算得和厚朴酚ABTS+·清除力为(2.524±0.092) mol Vc当量.

2.2 和厚朴酚的DPPH自由基清除力

和厚朴酚具有一定的DPPH自由基清除力，和厚朴酚在0～0.094 mmol/L(0～0.025 mg/mL)范围内，其DPPH自由基清除能力与其摩尔浓度呈正相关，线性方程为y=321.11x+1.712 4，决定系数R2=0.991 1(图2)；而Vc在0～0.114 mmol/L(0～0.02 mg/mL)范围内，Vc摩尔浓度与DPPH自由基清除率之间有良好的线性关系，线性方程为y=423.852x+19.476，决定系数R2=0.995 9(图2).计算得和厚朴酚DPPH自由基清除力为(0.291±0.014) mol Vc当量.

2.3 和厚朴酚的铁离子还原抗氧化能力

和厚朴酚具有很强的铁离子还原抗氧化能力，和厚朴酚在0～0.375 mmol/L(0～0.1 mg/mL)范围内，其铁离子还原抗氧化力与其摩尔浓度呈正相关，线性方程为y=1.241x+0.224，决定系数R2=0.992(图3)；而Vc在0～0.8 mmol/L(0～0.14 mg/mL)范围内，Vc摩尔浓度与铁离子还原抗氧化能力之间有很好的线性关系，线性方程为y=0.619 1x+0.177，决定系数R2=0.999 3(图3).计算得和厚朴酚铁离子还原抗氧化力为(2.150±0.172) mol Vc当量.

2.4 和厚朴酚的总还原力

和厚朴酚具有一定的总还原力，在0～3.755 mmol/L(0～1.0 mg/mL)范围内，和厚朴酚总还原力与其摩尔浓度呈正相关，线性方程为y=0.052x+0.082，决定系数R2=0.995 1(图4)；Vc在0～0.568 mmol/L(0～0.1 mg/mL)范围内，Vc摩尔浓度与总还原力之间有良好的线性关系，线性方程为y=1.064x+0.046 2，决定系数R2=0.996 3(图4)；计算得到和厚朴酚总还原力为(0.058±0.002) mol Vc当量.

2.5 和厚朴酚的亚铁离子螯合力

和厚朴酚具有一定的亚铁离子螯合力，和厚朴酚在0～1.877 mmol/L(0～0.5 mg/mL)范围内，它的亚铁离子螯合力与其摩尔浓度呈正相关，线性方程为y=19.852x+2.303 2，决定系数R2=0.990 4(图5)；而EDTA-2Na摩尔浓度与亚铁离子螯合能力的关系如图5所示，在一定范围内(0～0.269 mmol/L，即0～0.1 mg/mL)，EDTA-2Na摩尔浓度与亚铁离子螯合率(清除率)之间有良好的线性关系，线性方程为y=367.15x+0.018 2，决定系数R2=0.995 3；计算得和厚朴酚亚铁离子螯合力为(0.057±0.003)mol EDTA-2Na当量.

3 讨论与结论

自从Harman在1956年首次提出衰老自由基学说之后，机体的抗氧化研究就不断深入，很多药物具有抗氧化能力是因为其本身具有还原性、能螯合金属离子、提供氢供体、吸收电子及参与机体内酶调控等作用[21-23].和厚朴酚有多种生理活性可能与其抗氧化能力相关，赵超[15]研究了新木脂素类天然产物的抗氧化活性，结果发现和厚朴酚能够淬灭ABTS+·和DPPH自由基，抑制β-胡萝卜素-亚油酸的氧化，抑制2,2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(AAPH)、Cu2+/GSH和DNA被羟自由基(·OH)氧化的反应；但该研究仅仅明确了和厚朴酚具有体外抗氧化能力，且未设阳性对照(如Vc)，对它的抗氧化能力强弱也无试验数据支持.郝庆红等[24]研究了和厚朴酚对羟自由基的半数清除浓度、对过氧化氢的半数清除浓度，和厚朴酚对过氧化氢和羟自由基的清除作用要明显强于抗坏血酸，此研究仅显示和厚朴酚具有较强的羟自由基和过氧化氢清除能力，但对其它抗氧化指标的作用未见报导；且与用半数清除浓度(EC50)表示抗氧化活性大小方法相比，采用标准品当量为单位，更能定量地体现活性强弱.

本研究采用Vc、EDTA-2Na标准品当量为单位，研究了和厚朴酚的5个体外抗氧化活性指标，从多方面系统地反应出和厚朴酚的抗氧化活性.在一定的范围内和厚朴酚的ABTS+·清除力、DPPH自由基清除力、Fe3+还原抗氧化能力、总还原力和Fe2+螯合力均呈剂量依赖关系；对不同的指标和厚朴酚的抗氧化能力是不同的，和厚朴酚具有很强的ABTS+·清除力、一定的DPPH自由基清除力；虽然和厚朴酚总还原力的Vc当量较低、亚铁离子螯合力的EDTA-2Na当量较低，但和厚朴酚具有很强的铁离子还原抗氧化能力，能够说明和厚朴酚具有较高的体外抗氧化活性，该研究为将和厚朴酚开发成为抗氧化活性药物提供一定的理论依据.