具有不同N^N配体的金属铱配合物长磷光性质

侯雨桐 周治国 杨红 杨仕平

摘 要： 长磷光成像是指移除激发光源后的延迟发光，它无需实时激发光的照射，相比传统荧光成像有更高的信噪比.为了研究铱（Ir）配合物的长磷光性质，设计了3种C^N配体相同，而N^N配体不同的Ir配合物，在溶液层次研究了它们的长磷光性质.经过比较，将长磷光强度最强的3，8-二溴邻菲罗啉配合物制备成纳米粒子，在小鼠背部皮下进行长磷光成像，与荧光成像对比，呈现出更高的信噪比.

关键词： 铱（Ir）配合物; 长磷光; 活体光学成像

中图分类号： O 614.82⁺5  文献标志码： A  文章编号： 1000-5137（2020）02-0143-08

Long phosphorescence properties of iridium complexes with different N^N ligands

HOU Yutong， ZHOU Zhiguo， YANG Hong^*， YANG Shiping^*

（College of Chemistry and Materials Science， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China）

Abstract： Long phosphorescence imaging eliminates the real-time light irradiation and gets a higher signal-to-noise ratio than traditional fluorescence imaging.In order to study the long phosphorescence properties of iridium （Ir） complexes，we designed three kinds of iridium complexes with the same C^N ligands and different N^N ligands were designed.After comparison，the 3，8-dibromophenanthroline iridium complexes showed the strongest phosphorescence intensity and were prepared into water-soluble nanoparticles. Long phosphorescent imaging was performed subcutaneously on the back of mice， which showed a higher signal-to-noise ratio compared with fluorescence imaging.

Key words： iridium（Ir） complexes; long phosphorescence;in vivooptical imaging

0 引 言

由于成像時间短、灵敏度高等特点，光学成像在生物医学影像的诊断中已经得到了广泛的应用.然而，成像过程中所需的外界激发光会引起较强的组织自发荧光，严重限制了活体光学成像的空间分辨率.因此，像生物发光和切伦科夫发光这样不需要实时激发光的光学成像方式引起了人们的极大关注^[1-2].然而，生物发光通常需要酶和底物，其信号值常受到体内微环境和底物生物分布的影响^[3];而放射性同位素与发光材料相结合的辐射发光，需要核素的参与，不可避免地会产生一定程度的放射性危害，因此其应用相对复杂且局限^[4].

余辉或持久发光^[5]是光学成像领域中的又一焦点.因为具有去除光源后持续发光的现象，能够在体内实现无激发的实时零背景成像.从理论上讲，余辉材料的发光既可以来源于能量陷阱中空穴和电子的热激复合^[6]，也可以来源于常温下的长寿命激发态.目前对于余辉发光材料体内应用的报道主要集中于一些含有重金属离子的无机材料^[7-10]，通常会存在一定的生物毒性问题.

由于高活性的激发态，有机发光材料的发光寿命通常较短.无机金属离子，如铱离子（Ir^{3 +}）、铂离子（Pt²⁺）等配合物可以增强有机分子中单重态到三重态的过渡转变，通过产生能量缺陷来延长其发光时间.近年来，Ir配合物以其优异的光物理性质，如良好的光稳定性、大斯托克斯位移、室温下较高量子产率与较长的磷光发射寿命^[11-12]，及其配位结构合成的灵活性与多功能性，被广泛应用于光学探针，并在生物成像领域得到了越来越多的关注.大量研究表明，配体的结构对Ir配合物的分子前线轨道分布等性质影响很大，从而影响Ir配合物的发光颜色和发光强度，因此本文作者通过改变Ir配合物的配体结构来拓展其长磷光性质，通过比较邻菲罗啉、具有重原子和吸电子基团的3，8-二溴邻菲罗啉以及供电子基的噻吩邻菲罗啉这3种N^N配体不同的Ir配合物，在溶液层次研究了它们的长磷光性质，并选用长磷光性质最优的Ir配合物应用于活体长磷光成像.

1 实 验

1.1 试剂与仪器

水合三氯化铱、2，2'-联吡啶、2-苯基吡啶，百灵威科技有限公司提供;无二醇乙醚、甲醇（MeOH）、乙腈（MeCN），上海泰坦科技股份有限公司;聚醚（F127），萨恩化学科技（上海）有限公司.

紫外-可见吸收光谱（UV-Vis），美国贝克曼库尔特有限公司;稳态/瞬态荧光光谱仪FLS980，英国爱丁堡仪器公司;C13534-12 UV-NIR绝对量子效率测量系统，滨松光子学商贸（中国）有限公司;Nano-zs90马尔文粒径和电位仪，上海思百吉仪器系统有限公司;小动物活体光学成像系统/IVIS Spectrum，珀金埃尔默公司.

1.2 Ir配合物的合成与纯化

Ir配合物的合成路线如图1所示^[13-14].

2 结果与讨论

2.1 配合物的光物理性质

图2为Ir配合物1，2，3在MeCN或MeOH溶剂中的紫外-可见吸收光谱以及荧光发射光谱.从图2可知，3种Ir配合物的光谱在2种极性接近的溶剂中无明显差异.由于三者有相同的C^N配体，280～400 nm归属于配体C^N自旋¹LC（π-π^*）的单重态跃迁的吸收峰基本相同;而350～500 nm区间归属于Ir配合物中金属Ir和配体间的电荷转移态跃迁（¹MLCT和³MLCT），受N^N配体影响有所不同.常温下用360 nm激发，可以观察到3种Ir配合物分别在590，640，625 nm的磷光发射峰.

Ir配合物在MeCN和MeOH溶剂中的荧光寿命和量子产率如表1所示.Ir配合物在氮气（N₂）气氛下的荧光寿命和量子产率均比在空气气氛下高.由于Ir配合物2分子内含有重原子溴（Br），增强了系间窜越（ISC），影响了自旋轨道的相互作用，使Ir配合物2的量子产率高于Ir配合物1和Ir配合物3.

Ir配合物长磷光性质的测试方法如下：先在生物发光模式下采集溶液的背景信号，后用紫外灯持续照射1 min后移除光源，再在生物发光模式下采集溶液的信号值.为了探究3种Ir配合物的长磷光性质，对比相同浓度下3种Ir配合物在紫外灯照射前后的光学信号值.如图3所示，在移除光源后，溶液中的光学信号较照射前增强.通过定量分析发现，Ir配合物1溶液在照射前后信号值分别为0.46×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1和1.33×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1，照射后的值是初始值的2.9倍;Ir配合物3溶液在照射前后信号值分别为0.66×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1和2.28×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1，照射后的值是初始值的3.5倍;而Ir配合物2溶液由照射前强度0.52×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1变为照射后强度5.40×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1，为初始值的10.5倍.经对比，Ir配合物2经照射前后的光学信号强度增强最多.Ir配合物受激发时，由于Ir配合物2中的重原子Br具有高核电荷易使磷光分子的发生电子能级交错，导致磷光分子的自旋轨道耦合作用增强，促使电子在S1高核电态之间的ISC概率增大，从而有利于增大磷光量子效率，并提高了其磷光效果.

2.3 Ir配合物的长磷光衰减性质的研究

为了探究光学信号随时间变化的长磷光衰减，测试了5 mmol·L^-1的3种Ir配合物在MeOH溶液中经紫外灯照射1 min后移除光源，每隔30 s的长磷光信号.如图4所示，Ir配合物1，2，3溶液的初始信号强度依次为1.34×10⁵，4.38×10⁵，2.75×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1，其中Ir配合物2溶液的强度最高.3种Ir配合物的强度随时间延长逐渐降低，并分别在90，180，120 s时达到稳定保持不变.而MeOH溶液初始信号强度为0.25×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1，且随时间延长无显著变化.

在3种Ir配合物1 mmol·L^-1的MeCN溶液中进行了相同测试.经紫外灯照射后，Ir配合物1，2，3溶液的信号值依次为2.16×10⁵，4.45×10⁵和2.77×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1，3种Ir配合物溶液信号值随着时间延长逐渐下降，并分别在90，210，120 s时达到稳定.而MeCN溶液信号值为0.28×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1，且几乎不随时间延长而改变，无衰减过程.

以上研究证明：3种Ir配合物均具有移除激发光源后，强度随时间延长衰减的长磷光性质.其中Ir配合物2长磷光强度最强，衰减的速度最慢，证明其在能量转移过程中，能量的释放速度是三者中最缓慢的.特别是在不同濃度的Ir配合物溶液中，其磷光信号值接近，这可能是由于5 mmol·L^-1的Ir配合物物质的量浓度过高，存在一定的荧光淬灭，一定程度上抑制了长磷光强度.

2.4 Ir配合物2的长磷光强度与浓度的研究

经上述研究发现：在高浓度下，长磷光强度并不随浓度增加而增强.因此探究了低浓度Ir配合物溶液与磷光强度的关系.由于Ir配合物2的长磷光强度显著优于Ir配合物1和3，因此以Ir配合物2为研究对象.如图5所示，0.07，0.10，0.20，0.50，1.00 mmol·L^-15个不同物质的量浓度的Ir配合物2在MeCN溶液中用紫外灯照射1 min后，其长磷光强度依次为1.215×10⁵，1.285×10⁵，1.749×10⁵，2.589×10⁵，3.993×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1.随着浓度的增加，其磷光强度也增加.经线性拟合后，得出Ir配合物2长磷光强度（y）与物质的量浓度（x）的关系为y=2.968 4x+1.057 7（相关系数R²=0.996），说明在低浓度下，长磷光强度与Ir配合物的物质的量浓度呈线性正相关.

2.5 Ir配合物2纳米粒子的合成

为了最大限度地扩大其磷光性质，并实现Ir配合物的生物应用，根据之前的报道显示，H型聚集体能有效稳定三重激发态并增强在室温下的长磷光性质，因此最大限度地在纳米颗粒中形成H-型聚集是产生长时间磷光的关键因素.Ir配合物纳米粒子是通过表面活性剂聚醚F127与Ir配合物之间的疏水-疏水相互作用合成的^[15].F-127在反应体系中起到重要作用，一方面能够将Ir配合物包裹成水溶性纳米粒子，另一方面能够增强Ir配合物的H型聚集.Ir配合物2经改性制备成纳米粒子后的水合粒径在160 nm左右，由于包裹了带正电的Ir配合物，其Zeta电位显示在17 mV左右，较大的正电荷说明其在溶液中稳定性良好.

2.6 Ir配合物2纳米粒子的长磷光性质研究

为了进一步研究所制备的纳米粒子是否具有增强Ir配合物磷光性质的作用，对比了Ir配合物2在MeCN溶液中与Ir配合物2纳米粒子的长磷光强度，如图6（a）所示.当Ir配合物2的物质的量浓度为0.3 mmol·L^-1时，MeCN溶液与纳米粒子的磷光信号值分别为1.97×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1和4.91×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1，纳米粒子的信号值约为MeCN溶液的2.48倍;而在Ir配合物2的物质的量的浓度为0.6 mmol·L^-1时，MeCN溶液与纳米粒子的磷光信号值分别为2.20×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1和5.94×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1，纳米粒子的信号值约为溶液的2.70倍.在2种质量浓度下，Ir配合物2纳米粒子都能够增强溶液的磷光信号强度.这可能是由于在纳米粒子中Ir配合物2的聚集状态更强，增强了长磷光强度.

同样，测试了1 mmol·L^-1Ir配合物2纳米粒子的长磷光衰减过程，如图6（b）所示.其初始信號值为4.38×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1，在0～300 s内持续衰减，300 s后达到稳定在1.5×10⁵～1.4×10⁵p·s^-1·cm^-2·sr^-1.这与之前Ir配合物2在溶液状态下的初始强度以及衰减曲线结果类似，且达到信号衰减不变的时间较其在有机溶剂状态下更长，这证明将Ir配合物2制备成纳米粒子后，不仅没有改变其本身的长磷光性质，更增强了相同浓度下的Ir配合物磷光信号强度，延长了其持续发光的时间.

2.7 Ir配合物2纳米粒子在活体长磷光成像中的研究

由于长磷光成像具有无实时激发的零背景、高成像信噪比的优势，进一步研究了Ir配合物2纳米粒子的活体长磷光成像效果.以裸鼠为模型，在背部皮下注射1 mmol·L^-1，50 ?L Ir配合物2纳米粒子溶液，用紫外灯在其上方1 cm处照射1 min，移除光源，在生物发光成像模式下，采集其背部的信号值，同时通过荧光成像采集背部信号强度.长磷光成像与荧光成像的对比图以及注射纳米粒子部位的成像信号强度与腹部肌肉区域成像信号强度的比值，如图7所示.

如图7（a）所示，长磷光成像可以明显区分出背部注射材料的位置，与其他背部部分对比明显、成像清晰、信噪比高（1.47±0.31）.而在荧光成像中，由于激发波长短，小鼠背部的其他区域有很强的背景荧光，致使注射材料区域的信号并不明显，信噪比低（0.14±0.05）.从数值对比而言，长磷光成像的信噪比约为荧光成像的10.5倍.

3 结 论

为解决传统Ir配合物激发波长短、背景荧光强、不利于活体成像的缺点，设计了3种不同N^N配体的金属Ir配合物，在MeCN和MeOH 2种溶液体系中比较了它们的长磷光性质.实验表明：3种Ir配合物都能够在紫外灯照射一段时间移除光源后，表现出随时间延长强度衰减的长磷光信号.其中，Ir配合物2由于其含有2个Br原子，其磷光强度相比其他2种Ir配合物更高，约为Ir配合物1和3的3倍，而衰减速度表现比Ir配合物1和3更慢，平均多出约100 s的时间达到稳定，说明在该条件下的磷光寿命要高于Ir配合物1和3.为了增强Ir配合物的聚集并拓展其在活体长磷光成像中的应用，通过F127将Ir配合物2制备成水溶性纳米粒子，并比较了荧光成像与长磷光成像模式下对小鼠皮下的成像效果，结果证实长磷光成像的信噪比约为荧光成像的10倍.这种成像方式为Ir配合物的活体光学成像提供了新的指导思路，有助于拓展更多Ir配合物在长磷光领域的研究.

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（責任编辑：郁 慧，顾浩然）

收稿日期： 2019-11-10

基金项目： 国家自然科学基金（21877080）

作者简介： 侯雨桐（1994—），女，硕士研究生，主要从事配位化学方面的研究.E-mail：hyt11024688@163.com

通信作者： 杨 红（1978—），女，教授，主要从事生物无机化学方面的研究.E-mail：yanghong@shnu.edu.cn;杨仕平（1969—），男，教授，主要从事生物无机化学方面的研究.E-mail：shipingy@shnu.edu.cn

引用格式： 侯雨桐，周治国，杨红，等.具有不同N^N配体的金属铱配合物长磷光性质 [J].上海师范大学学报（自然科学版），2020，49（2）：143-150.

Citation format： HOU Y T，ZHOU Z G，YANG H，et al.Long phosphorescence properties of iridium complexes with different N^N ligands [J].Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2020，49（2）：143-150.