原头蚴外泌体对树突状细胞活化和细胞因子分泌的影响

李宗吉，梁锦屏

（1. 宁夏医科大学 基础医学院，宁夏 银川 750004；2. 宁夏医科大学总医院 临床病原生物重点实验室，宁夏 银川 750004；3. 宁夏医科大学 临床医学院，宁夏 银川 750004）

包虫病是由棘球绦虫的幼虫感染并寄生于人、家畜及啮齿类动物体内引发的一种呈世界性分布的人畜共患寄生虫病，该病严重危害农牧业地区人畜健康和经济发展。就目前而言，研制包虫病疫苗，进行免疫预防是控制包虫病传播的最为理想的方法[1-3]。在寄生虫病的防治研究中，无论是筛选具有早期诊断价值的分子，还是寻找抗包虫病新型药物作用的靶点及疫苗分子，均是以对寄生虫与宿主免疫反应的分子基础及机理等各个过程的深入研究为基础。细粒棘球蚴感染宿主产生的免疫应答机制极为复杂，成囊及囊泡对棘球蚴的存活、长期稳定寄生宿主、持续感染至关重要。另一方面细粒棘球蚴能长期寄生于宿主体内，必然产生了有效的逃逸机制，涉及虫体与宿主免疫系统的细胞通讯及其引发的细胞免疫。目前，国内外已陆续开展了相关研究工作，认为包囊内的原头蚴所表达和分泌的成分在虫体不同发育方向、棘球绦虫侵入宿主、寄生虫与宿主之间的相互作用，以及虫体免疫逃避中发挥着重要作用[4-6]。寄生虫在宿主体内的寄生机制复杂，现有研究表明，毛滴虫、疟原虫、弓形虫、锥虫和血吸虫等多种寄生虫均可分泌外泌体，称为虫源外泌体。外泌体是细胞间信息交流的重要途径之一，其在抗原提呈、信号转导等过程中发挥重要作用[7]。虫源外泌体可以作为寄生虫与宿主之间联系的纽带，一方面，寄生虫在多种机制刺激下产生外泌体，外泌体包裹着大量虫源性信息进入宿主体液及细胞内，调节宿主的免疫系统，抑制炎症反应，改善其寄生环境；另一方面，外泌体可直接携带有毒有害物质进入宿主循环系统。不同虫源外泌体成分不同，作用机制也不尽相同。如弓形虫感染后释放的外泌体能刺激树突状细胞（DCs）成熟，进而激活Th1 调节的弓形虫特异性免疫反应，从而提高抗感染能力[8]；布氏锥虫分泌外泌体抑制宿主DCs 的成熟和活化从而导致了锥虫耐受[9]。但由于包虫生活史较为复杂，包虫的相关研究相对还较为滞后，包虫外泌体蛋白质及其miRNA 成分对宿主免疫效应尚未明确，尤其是外泌体被DC 吞噬后外泌体成分对DCs 靶细胞分化、成熟及细胞因子分泌的作用尚未见报道。本研究旨在探讨囊型包虫原头蚴（Protoscoleces，PSC）分泌的外泌体（Protoscoleces exosome，PE）的生物学特性及其对DCs 活化和细胞因子分泌的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 PE 提取试剂盒购自Invitrogen公司；白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）、IL-10、TNF-α和IL-12 的ELISA 检测试剂盒均购自Sigma 公司；青霉素、链霉素购自美国GIBICO 公司；抗小鼠FITC-CD11c、 PE-CD86、 PerCP-CD80、 FITC-CD40、APC-MHCⅡ及其同型对照，均购自美国eBioscience公司；CD11c分离试剂盒，Cytometric bead array kit 购自美国BD 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司。Guava easyCyte™流式仪购自美国Millipore-Sigma 公 司。6 周 龄～8 周 龄 雄 性ICR 小 鼠，体 质 量（18±2）g，购自宁夏医科大学实验动物中心。从宁夏医科大学附属医院肝胆外科包虫病患者手术摘除的完整包囊中无菌条件下抽取囊液，-80 ℃冻存备用。

1.2 PE 的提取和鉴定 取囊液上清，12 000 r/min 离心30 min 去除细胞碎片，按照PE 提取试剂盒的步骤从上清中提取PE，PBS 重悬后取10 μL 的PE 重悬液滴加至铜网上，室温静置10 min后用滤纸吸去多余液体，滴加1%的醋酸双氧铀，室温染色5 min，待完全干燥后于扫描电镜下观察其形态和大小。同时，将提取的PE 沉淀中加入去离子水15 mL，充分摇晃悬浮，转移入100 ku 超滤离心管，4 000 r/min 30 min，离心2 次，提取超滤后的浓缩液即为原头蚴外泌体超滤裂解物（Protoscoleces exosome lysates，PEL）。

1.3 DCs 分选及抗原刺激培养 ICR 小鼠颈椎脱臼迫杀后无菌取脾脏，加入2 mL PBS 后匀浆，200 目尼龙膜过滤，滤液加5 倍红细胞裂解液溶解红细胞，2 000 r/min 离心5 min 后弃上清，用PBS 洗涤2次，制备脾单细胞悬液。采用CD11c分离试剂盒分选DC，利用流式细胞仪鉴定其纯度＞90%的留存备用。将分选获得的CD11c DCs 细胞悬液（5×106个/mL），100 μL/孔加至24 孔细胞培养板。分为LPS 刺激组、PE 刺激组、PEL 刺激组和PBS 阴性对照组，分别加入100 μL 的LPS、PE、PEL 及等体积PBS，使LPS 终浓 度 为1 μg/mL，PE 和PEL 终 浓 度 均 为10 μg/mL。RPMI1640 培养基加至1 mL，每组设重复孔，5%CO237 ℃培养24 h，收集上清及培养后的DCs，备用。

1.4 DCs 表型测定 利用PBS 重悬1.3 中收集的DCs，分别加入10 μL FITC-CD11c、PE-CD86、PerCPCD80、FITC-CD40、APC-MHCⅡ抗体，同时设置不加抗体的空白对照。避光孵育30 min，用流式染色缓冲液洗涤，每管各加入100 μL 流式缓冲液重悬细胞，用Guava easyCyte™流式仪检测不同组抗原刺激培养后DCs 表面表达的CD40、CD80、CD86、MHCⅡ分子水平。

1.5 ELISA 方法分析IL-6、IL-10、TNF-α和IL-12含量 收集1.3中各DCs抗原刺激细胞的培养上清，利用相应ELISA 检测试剂盒检测各组细胞上清中IL-6、IL-10、TNF-α和IL-12含量。

1.6 统计学分析 采用SPSS16.0 统计软件进行统计分析，数据用（-X±S）表示，计量资料采用t-test 检验，p＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 原头蚴PE形态观察 扫描电镜下观察可见PE为形状大小较为均一的圆形或椭圆形单层囊泡结构。直径约30 nm～200 nm，平均直径90 nm，有完整脂质包膜。符合PE 的标准形态结构（图1）。表明分离得到原头蚴PE，且数量较多。

2.2 DCs 细胞分离 采用CD11c 分离试剂盒分选DCs，流式细胞仪鉴定其纯度为91.63%（图2）。表明得到较为纯净的DCs，可以用于下一步实验。

2.3 DCs 表型测定结果 利用流式细胞仪检测各组DCs 表型，结果显示，PE 组DCs 表面表达CD40、CD80、CD86、MHCⅡ的比例分别为（42.23±2.74）%、（61.08±3.54）%、（54.62±1.56）%、（59.62±1.04）%，PEL 组DCs 表面表达CD40、CD80、CD86、MHCⅡ的比例为（56.12±4.32）%、（76.56±3.54）%、（65.32±2.15）%、（68.35±2.65）%，PEL 组结果明显高于PE组，两组较PBS 组的（29.1±4.62）%、（28.81±6.54）%、（27.37±2.65）%、（26.83±2.51）%均显著升高（p＜0.05），3 组均低于LPS 组（61.33±4.25）%、（81.23±2.42）%、（76.12±1.96）%、（79.15±2.55）（图3）。PEL组DCs 表达MHCⅡ和共刺激分子（CD40、CD80、CD86）水平高于PE 组。表明PEL 组比PE 组能更为有效的刺激DCs 活化和成熟。

图1 原头蚴PE 的电镜照片（放大倍数5×104）Fig.1 Electron microscopic photographs of protoscoleces exosome(Magnification ratio 5×104)

图2 FACS 检测分离DCs 表面CD11c 阳性率Fig.2 Percentage of CD11c positive DCs tested by FACS

图3 DCs 表型CD40、CD80、CD86、MHCⅡ测定结果Fig.3 Determination of DCs phenotype CD40,CD80,CD86 and MHCⅡ

2.4 细胞因子测定结果 利用ELISA 检测试剂盒检测各组培养细胞上清中细胞因子含量，IL-6测定结果显示，PBS、PE、PEL、LPS 组DCs 培养上清中，PE组＞PEL 组＞LPS 组＞PBS 组，PE 组IL-6 的含量显著高于PBS、PEL、LPS 组（p＜0.05），PEL 和LPS 组均明显高于PBS 组，但两组间无显著性差异；IL-10 测定结果显示，LPS组＞PE组＞PEL组＞PBS组，PE组和LPS组明显高于PBS 和PEL 组，PEL 组高于PBS 组，PE 组和LPS 组（p＜0.05）无显著性差异；IL-12 测定结果显示，LPS 组＞PEL 组＞PE 组＞PBS 组，4 组间均有显著性差异（p＜0.05）；TNF-α测定结果显示，LPS 组＞PEL 组＞PE 组＞PBS 组，4 组间均有显著性差异（p＜0.05）（图4）。表明PEL 可更有效刺激DCs 生成Th1 类细胞因子（IL-12、TNF-α），PE 可更有效刺激DCs 生成Th2类细胞因子（IL-10、IL-6）。

图4 PBS、PE、PEL、LPS 组IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α细胞因子水平Fig.4 Expression level of IL-6,IL-10,IL-12,and TNF-α

3 讨 论

各种病原体感染所释放的PE 中包含有病原体特异性蛋白，一方面可作为病原体感染特异性诊断标志物，另一方面PE 中的抗原直接暴露于宿主的免疫系统，具有很强的抗原性，能够调节宿主局部及全身产生免疫反应，对于逃避宿主的免疫攻击，以保障虫体的生长分化、营养代谢和增殖、以及虫体的存活十分重要。 例如在疟原虫感染中，PE 可携带疟原虫特异抗原，诱导宿主产生抗体[10]；在利什曼虫感染中，发现PE 含有糖酵解酶有助于寄生虫在宿主体内的存活及播散[11]。与蛋白质类似，病原体PE 含有特异性的核酸物质，其中最主要的物质为miRNA，PE 被认为是“miRNA 运输载体”，exosomal miRNA 在细胞外环境中比游离miRNA 更加稳定，且PE miRNA 可介导细胞通讯，能特异性抑制靶细胞中的靶基因表达[12]。Exosomal miRNA 可被DCs、单核、巨噬细胞等靶细胞摄入，释放其中的microRNA，从而调控靶细胞分化及其免疫功能。病原体来源的exosomal microRNA 可以被抗原递呈细胞（APC）内摄继而抑制靶细胞内mRNA 的基因表达而影响APC 的免疫功能，极有可能是病原体源性PE 诱导免疫逃逸的原因之一[13-14]。DCs 是已知功能最强且惟一能激活幼稚T 淋巴细胞的专职APC。在寄生虫感染中，一方面DCs 是机体产生抵抗寄生虫免疫反应的关键环节，另一方面寄生虫也大都是通过影响DC的正常功能而完成免疫逃避[15]。不同来源的寄生虫致敏DCs 后，成熟DC 诱导T 细胞活化，使之向效应性T 细胞分化以增强抗感染免疫应答，而未成熟DC则诱导T 细胞产生免疫耐受，其主要机制之一就是使T 细胞向CD4+CD25+Treg 细胞方向分化[16]。目前，病原体分泌的PE 在细胞免疫功能中的作用，仍然处于研究起步阶段，可能既具有激活细胞免疫功能，又可能诱导细胞免疫耐受导致免疫逃逸[17]。

本研究分离获得原头蚴虫体分泌至体外的虫源PE，采用电镜技术观察了PE 的形态结构。为了探索PE 中蛋白质和miRNA 成分可能在机体免疫反应中的作用，本研究采用去离子水低渗裂解PE，结合超滤离心技术，从而去除PE 中的miRNA 成分，保留PE 的囊壁蛋白成分。利用PE 和加工处理的PEL成分分别刺激DCs，观察其对DCs 表型和细胞因子分泌的影响，初步分析PE 主要成分在DCs 活化和免疫调节中的作用。研究中发现：PE和PEL成分都可有效刺激DCs 高表达CD40、CD80、CD86、MHCⅡ分子，这些分子为DCs 活化成熟的标志性分子。PEL 上调CD40、CD80、CD86、MHCⅡ表达的作用明显高于PE，表明通过去除miRNA成分之后的PE 蛋白质成分能更有效刺激DCs 活化和成熟，而成熟的DCs 可将抗原递呈并活化T 细胞，同时成熟DCs 可分泌多种细胞因子，调节Th 细胞，在机体抗感染过程中发挥重要的免疫调节作用。同时，PEL刺激组DCs细胞分泌IL-12、TNF-α水平显著高于PE 组，表明PEL除了诱导DCs 活化成熟以外，还能促进DCs 高分泌细胞因子IL-12、TNF-α，这类细胞因子能诱导Th向Th1 型细胞分化，激活细胞免疫应答，有利于机体免疫清除寄生虫感染。而含有miRNA 成分的PE激活DCs 的能力明显低于PEL，而且其刺激DCs 分泌的IL-12、TNF-α水平较PEL 相对较低，而具有免疫抑制功能的IL-6、IL-10 细胞因子的水平明显高于PEL 组，提示PE 含有的miRNA 成分很可能通过对DCs 分化及基因表达谱产生负向调节，抑制Th1型免疫反应，参与虫体的免疫逃逸。

本研究初步开展体外DCs 刺激试验，发现PE 可有效激活DCs 并促使其分泌细胞因子，诱导机体产生特异性免疫应答作用，这为包虫病疫苗设计提供了参考依据。通过对PE 进一步的加工处理，对比发现：去除PE 的miRNA 成分可加强其激活细胞免疫功能，更有效地发挥其抗感染免疫应答反应的特异性；也提示PE miRNA 可能参与虫体的免疫逃逸过程。后续研究还需进一步分析、鉴定PE 的成分，并深入探索其在免疫调节中的作用。通过这些研究使PE 这种易于操作、调控、含有病原体特异性成分的亚细胞单位，能够为全面认识包虫感染中虫体与宿主通讯方式及免疫机理，尤其是免疫逃逸奠定基础，并为病原体感染中的临床诊断、免疫治疗、药物和疫苗的开发提供了新的思路。同时这些信息也可能丰富慢性感染免疫学知识。