心脑疏通胶囊指纹图谱研究

周 和1 谭翔匀1 冯 华1 王 奥2

1.遵义市食品药品检验所，贵州 遵义 563002；2.遵义产品质量检验检测院，贵州 遵义 563002

心脑疏通胶囊由丹参、川芎、法半夏、茯苓等11味中药材组成，具有益气活血、化瘀通络之功效，用于气虚血滞、脉络瘀阻所致中风后遗症，半身不遂、肢体麻木及心脑血管供血不足等[1-2]。丹参中丹参酮类化合物有抗菌消炎、祛瘀止痛等作用，是心脑疏通胶囊发挥功效的指标性成分之一[3-4]。该中药制剂现有质量标准比较简单，只有川芎、枸杞子等几味药材的薄层鉴别，难以准确、全面地表达该制剂的整体质量和疗效。

中药指纹图谱具有整体性、相似性的特点，是一种能突出中药及其制剂完整面貌的有效方法[5-6]，有助于中药及其制剂内在化学成分的综合评价。近年来，中药指纹图谱技术已广泛应用于多种中药及其制剂的质量控制[6-10]。本研究以处方中丹参酮类成分(丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I)为切入点，采用梯度洗脱模式，建立心脑疏通胶囊HPLC指纹图谱，以期为心脑疏通胶囊的识别和质量控制提供一定的参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂 Agilent 1260高效液相色谱议(美国安捷伦公司)，Waters XSelect C18 (4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；MS204TS型梅特勒电子天平(北京中恒日鑫科技有限公司)，KQ-500DV型数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与药品 丹参酮IIA(98.9%，批号：110766-201721)、隐丹参酮(99.1%，批号：110852-201605)、丹参酮I(98.2%，批号：110867-201705)，心脑疏通胶囊(批号：161201、161202、161203购买于遵义市中医院，19101601、19101602、19101603、19102101、19102102、19102103、19102104为自制)。乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司)，纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，乙醚(成都金山化学试剂有限公司)，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱waters XSelect C18(4.6 mm ×250 mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0-5min，85% B；5-20min，85% B→50% B；20-35min，50% B→30% B；35-45min，30% B→10% B；45-65min，10% B)；检测波长：270nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 称取丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I对照品适量，分别用甲醇溶解制成含丹参酮IIA 212.63μg/mL、隐丹参酮47.52μg/mL、丹参酮I的单一对照品溶液，摇匀，用0.22μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.2.2 供试品溶液 取心脑疏通胶囊内容物适量，研细，取约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入乙醚50mL，静置24h(时时振摇)，过滤，滤液蒸干，用甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，定容，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取“2.2.2”项下供试品溶液(批号：161201)按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，主要共有峰与17号丹参酮IIA参照峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于0.93%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取心脑疏通胶囊(批号：161201)内容物适量，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，共6份，按上述色谱条件进样测定，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果，20个共有峰相对保留时间RSD均小于1.29%(n=6)，相对峰面积的RSD均小于1.83%(n=6)，表明重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取(批号：161201)同一供试品溶液，分别在0、2、5、8、12、24h进样检测，共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD(n=6)均小于2.62%，表明供试品溶液于室温下放置24h内基本稳定。

2.4 指纹图谱生成与相似度评价、共有峰的指认及相关分析

2.4.1 指纹图谱的生成 取10批心脑疏通胶囊内容物适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行测定。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版”分析处理得心脑疏通胶囊HPLC指纹图谱，如图1、图2所示。

图1 样品的HPLC对照图谱

图2 10批样品的HPLC叠加指纹图谱

2.4.2 相似度分析 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(版本 2004 A)”，以S1号样品(161201)为对照指纹图谱，进行整体相似度评价。结果显示，10批样品相似度均大于0.95，表明各样品间差异小，质量稳定性良好，详见表1。

表1 相似度评价结果

2.4.3 共有峰的指认 分别取“2.2.1”项下丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I的单一对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件依次测定，并与样品对照图谱进行对比指认。结果，共有峰中17、12、13号色谱峰分别指认为丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I，如图1、图3所示。

2.4.4 共有峰的相关分析 10批样品总峰31个，共有20个共有峰，其峰面积总和占色谱峰总面积的91.49%，具有较大代表性。其中，17号峰丹参酮IIA峰面积大，含量较高，峰形好，分离度为2.09，在样品中较稳定，故以其保留时间和峰面积为参照，计算其它共有峰的相对保留时间和相对峰面积。各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均在3%范围内，无显著性差异。结果详见表2、表3。

图3 对照品HPLC色谱图

表2 共有峰相对保留时间

表3 共有峰相对峰面积

3 讨论

研究对比考察甲醇、乙醚两种提取溶剂，结果发现甲醇提取液的色谱峰繁杂，不易分离，而用乙醚提取时，基线较平稳，各色谱峰保留时间适中，故选择乙醚为提取溶剂。此外，经多次梯度洗脱模式摸索，对甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、甲醇-醋酸溶液、乙睛-水、乙睛-磷酸溶液、乙睛-醋酸溶液6个流动相考察发现：乙腈-0.1%磷酸溶液对样品成分的梯度洗脱效果最好。同时采用DAD检测器进行紫外区全波长扫描，发现在270nm波长下色谱图基线噪音较低，色谱峰数目多，保留时间适中，有利于指纹图谱分析，因此选择270nm为检测波长。

综上所述，本研究首次建立心脑疏通胶囊的HPLC指纹图谱，确认20个共有峰，标示指认了丹参酮IIA(17号)、隐丹参酮(12号)、丹参酮I(13号)3个成分，10批样品相似度均在0.95以上。该方法简便、准确、重现性好，可为心脑疏通胶囊的质量控制提供可靠一定的参考。在色谱图中，以丹参酮IIA和隐丹参酮含量相对较高，可用于定量检测分析，笔者将进一步深入研究，完善心脑疏通胶囊的质量控制。