藏药如意珍宝片的质量标准研究

许宗仁1 包旭宏2

1. 甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730030；2. 甘肃奇正藏药有限公司，甘肃 兰州 730010

如意珍宝丸收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》1995年版藏药第一册第317页，又名“桑培奴布日布”，原剂型为丸剂[1]。为解决传统藏药丸剂丸重差异大、崩解时限不易控制，卫生学指标不合格等问题。甘肃奇正藏药有限公司按照国家药品监督管理局有关规定的要求[2]，将丸剂改为片剂并获得生产批件(批件号：Z20100061)。如意珍宝丸成分复杂，包含挥发性成分、生物碱、无机盐、黄酮类、脂肪酸、氨基酸等。原标准只有红花和降香药材的显微鉴别，在中医药现代化迅猛发展的今天，原标准已然不能很好地控制产品的质量[1]。本研究通过查阅文献并结合自身实验研究，增加了乳香、降香、木香和丁香4个药材的TLC薄层鉴别方法和红花、荜茇2个药材的HPLC含量测定方法，对该药的质量标准做了提高和完善。

1 实验材料

1.1 仪器 安捷伦1160高效液相色谱仪(美国Agilent公司)：包括LC-295紫外可见检测器，200LC泵，ANAS-TAR色谱工作站；SK8200HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；HY-4调速多用振荡器(金坛市华峰仪器有限公司制造)；XS205DU分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司生产)。

1.2 试药 甲醇、乙腈均为色谱纯试剂(购自赛默飞世尔科技中国有限公司)，其余为分析纯。硅胶G板(青岛海洋化工有限公司)；乳香对照药材(批号：12907-201702)；降香对照药材(批号：120952-201804)；木香对照药材(批号：120921-201709)；丁香酚对照品(批号：110725-201716)；羟基红花黄色素A(批号为：111637-201810)；胡椒碱对照品(批号为：110775-201706)，以上对照品和对照药材均购自中国食品药品检定研究院。 如意珍宝片由甘肃奇正藏药有限责任公司提供。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 处方中乳香的薄层鉴别 取本品6片，研细，置于锥形瓶中，加入10.0 mL的95%乙醇，超声提取30 min，滤过，滤液蒸干后放冷，残渣加甲醇1.0 mL使溶解，作为供试品溶液。另取乳香对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。再按处方比例及制备工艺，配制不含乳香的阴性对照样品，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015版通则0502，下同)试验，分别用毛细管取上述两种溶液各5 μL，依次点于同一硅胶G薄层板(10 cm×10 cm)上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(15:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛试液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上显相同的褐色斑点，且阴性无干扰。照片见图1。

供试品：1、2、3样品 4、5乳香对照药材 6、阴性对照图1 如意珍宝片(乳香)药材薄层鉴别

2.1.2 降香的薄层鉴别 取本品6片，研细，置于锥形瓶中，加入20.0 mL的95%乙醇，超声提取30 min，滤过，滤液蒸干后放冷，残渣加甲醇2.0 mL使溶解，作为供试品溶液。另取降香对照药材1.0 g，加乙醇10.0 mL，同法制成对照药材溶液。再按处方比例及制备工艺配制成不含降香的阴性对照样品，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，分别用毛细管取上述溶液各5 μL，依次点于同一硅胶G薄层板(10 cm×10 cm)上，以甲苯-乙酸乙酯(2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，至紫外灯(365 nm)下检视，在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上显相同的浅蓝色荧光斑点，阴性无干扰。再喷以1%香草醛试液与无水乙醇(1∶9)的混合液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上显相同的棕色斑点，且阴性无干扰，照片见图2、图3。

供试品：1、2降香对照药材，3、4样品， 5、6阴性对照图2 如意珍宝片(降香)药材薄层鉴别(365nm荧光检视)

供试品：1、2降香对照药材，3、4样品，5、6阴性对照图3 如意珍宝片(降香)药材薄层鉴别显色后检视

2.1.3 木香的薄层鉴别 取本品6片，研细，置于具塞锥形瓶中，加入15.0 mL乙醚，密塞，振摇提取1 h，滤过，滤液浓缩至1.0 mL，作为供试品溶液。另取去木香对照药材0.5 g，同法制成每0.5 mg/mL的对照药材溶液。再按处方比例及制备工艺配制成不含木香的阴性对照样品，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，分别用毛细管取上述溶液各5 μL，依次点于同一硅胶G薄层板(10 cm×10 cm)上，以石油醚(60～90 ℃)-苯-醋酸乙酯(5∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸试液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同的蓝绿色斑点，且阴性无干扰，照片见图4。

供试品：1、2木香对照药材，3、4样品，5、6阴性对照图4 如意珍宝片(木香)药材薄层鉴别

2.1.4 处方中丁香的薄层色谱鉴别 取本品6片，研细，置于锥形瓶中，加入20.0 mL正己烷，振揺提取10 min，滤过，滤液蒸干后放冷，残渣加正己烷1.0 mL使溶解，作为供试品溶液。另取丁香酚对照品(ρ=1.067)0.5 mL，加正己烷稀释至25.0 mL，摇匀，制成浓度为21.3 mg/mL的对照品溶液。再按处方比例及制备工艺，配制不含丁香的阴性对照样品，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，分别用毛细管取对照品溶液0.5 μL、取供试品液和阴性溶液各2 μL，依次点于同一硅胶G薄层板(10cm×20cm)上，以石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛试液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同的棕黄色斑点，且阴性无干扰。照片见图5。

供试品：1、2丁香酚对照品，3、4样品，5、6阴性对照图5 如意珍宝片(丁香)药材薄层鉴别(日光灯下检视)

2.2 羟基红花黄色素A的HPLC含量测定

2.2.1 色谱条件 十八烷基键合硅胶为填充剂；色谱柱：Kromasil 100-5- C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm大连依利特分析仪器有限公司生产)；流动相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸(26∶2∶72)；流速：0.80 mL/min；检测波长：403 nm；柱温：室温。

2.2.2 色谱系统适用性试验 在“2.2.1”中的色谱条件下，羟基红花黄色素A与其余杂质峰分离效果较好，理论板数以羟基红花黄色素A峰计，应不低于2500。

2.2.3 对照品溶液与供试品溶液及阴性溶液的配制 取羟基红花黄色素A对照品5.0 mg于25 mL容量瓶中，加25%甲醇至刻度，摇匀，制成每0.2 mg/mL的对照品溶液。另取本品20片，研细后精密称取5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25%的甲醇50.0 mL，称定重量，超声提取(功率160 W，频率59 kHz)40 min，放冷，用25%的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5.0 mL于10.0 mL容量瓶中，加25%的甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液。再按处方比例及制备工艺配制成不含红花的阴性对照样品，取5.0 g，同法制成阴性对照溶液。

2.2.4 专属性试验 精密吸上述取供试品溶液、阴性液和对照品溶液各20 μL注入液相色谱仪中，在与羟基红花黄色素A对照品色谱峰相应的位置上，供试品液具有相同保留时间的色谱峰出现；而阴性对照溶液在该处无色谱峰，说明专属性良好。说明专属性良好。见图6。

图6 羟基红花黄色素对照品(A)、如意珍宝片样品(B)、红花阴性样品(C)

2.2.5 线性关系的考察 精密吸取上述对照品溶液(0.2 mg/mL)各0.5、1、1.5、2.5、4.5、5.0 mL、分别置于10.0 mL的容量瓶中，加入25%的甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。取上述对照品溶液各20 μL，按照“2.2.1”项下的色谱条件，注入液相色谱仪，测定峰面积，结果见表1。以峰面积值为纵坐标，进样量为横坐标作图，进行线性回归分析，得出羟基红花黄色素A的标准曲线方程、相关系数及线性范围，见图7。结果表明其在0.01～0.1 mg/mL浓度范围内峰面积与对照品的浓度线性关系良好，其回归方程为y=72397x+28.857(r=0.9999)。

表1 羟基红花黄色素A对照品浓度与峰面积数据

2.2.6 精密度试验 取如意珍宝片(批号: 20180401)，按照“2.2.3”项下的方法，制成供试品溶液，依“2.2.1”项下的色谱条件，精密吸取供试品溶液，重复进样5次，测定羟基红花黄色素A峰面积值，其平均值为2133.42，RSD值为0.62%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一批号的供试品(批号20180401)，按照“2.2.3”项下处理方法，制成供试品溶液，按照“2.2.1”项下的色谱条件，精密吸取该供试品溶液20 μL，分别于0、2、4、6、8 h进样，测定峰面积，样品在8 h内稳定性良好，平均值为2317.8，RSD值为0.44%。

2.2.8 重现性试验 取本品(批号:20180401)5份，按照“2.2.3”项下处理方法，制备5份供试品溶液，分别测定，记录峰面积。计算羟基红花黄色素A的含量及RSD值，结果重现性较好，平均值0.644 mg/g，RSD值为1.77%。

2.2.9 回收率试验 取已知含量(0.64 mg/g)的如意珍宝片(批号: 20180401)6份，研细,每份约1.5g，精密称定，分别加入2.0 mL浓度为0.2 mg/mL的羟基红花黄色素A对照品溶液。再按照“2.2.3”项下处理方法，制成供试品溶液，根据“2.2.1”项下的色谱条件依法测定，供试品中羟基红花黄色素A的加样回收率的RSD值为1.86%，表明该方法回收率良好。结果见表2。

表2 回收率试验数据

2.2.10 样品中羟基红花黄色素A的含量测定 取7批样品(批号：180401、180402、180506、180507、180608、180709、180801)，每批2份，按照“2.2.3”项下处理方法，制成供试品溶液，精密吸取供试品溶液20μL，按照“2.2.1”项下的色谱条件，依法测定，记录峰面积、计算羟基红花黄色素A的含量，结果见表3。

表3 样品中羟基红花黄色素A的含量测定数据

2.3 胡椒碱的含量测定

2.3.1 色谱条件 十八烷基键合硅胶为填充剂；色谱柱：Kromasil 100-5- C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大连依利特分析仪器有限公司生产)；流动相：甲醇-水(65:35)；流速：1.0 mL/min；检测器: DAD检测器；检测波长：350 nm；柱温：室温。

2.3.2 色谱系统适用性试验 在该色谱条件下，胡椒碱与其余杂质峰分离效果较好，理论板数以胡椒碱峰计应不低于13000。

2.3.3 对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液的配制 称取胡椒碱对照品0.40 mg，精密称定，置于10.0 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取本品15片，研细后精密称取3.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入30.0 mL甲醇，称定重量，超声提取(功率160 W，频率59 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤取1.0 mL，作为供试品液。再按处方比例及制备工艺配制成不含荜茇的阴性对照样品，取3.0 g，同法制成阴性对照溶液，备用。

2.3.4 专属性试验 精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL注入液相色谱仪，在与胡椒碱对照品色谱峰相应的位置上，供试品液具有相同保留时间的色谱峰出现；而阴性对照溶液在该保留时间无色谱峰，说明专属性良好。见图8。

图8 胡椒碱对照品(A)、如意珍宝片样品(B)、荜茇阴性对照(C)

2.3.5 线性关系考察 取胡椒碱对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成 0.005、0.010、0.020、0.041、0.082、0.163 mg/mL对照品溶液，取上述对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，结果见表4。以峰面积值为纵坐标，进样量为横坐标作图，进行线性回归分析，得出胡椒碱的标准曲线方程、相关系数及线性范围，见图9。结果表明，胡椒碱在0.005～0.163 mg/mL内峰面积与对照品的浓度呈良好的线性关系，其线性方程为y=56094x+33.384(r=1)。

表4 胡椒碱对照品浓度与峰面积数据

2.3.6 精密度试验 精密吸取同一对胡椒碱照品溶液(0.041 mg/mL)10μL，连续进样6次，测定其峰面积，结果表明，精密度良好，平均值2355.07，RSD值为0.22%。

2.3.7 稳定性试验 取本品(批号: 20190801)3.0g，按照“2.3.3”项下处理方法，制成供试品溶液，再按照“2.3.1”项下的色谱条件，精密吸取该供试品溶液10μL，于0、2、4、6、12、24、48 h分别进样，测定峰其面积。结果显示，样品在在48 h内测定，稳定性良好，平均值为1958.1，RSD值为2.19%。

2.3.8 重现性试验 取本品(批号: 20190801)6份，按照“2.3.3”项下处理方法，制成供试品溶液，再按照“2.3.1”项下的色谱条件，分别进样，计算胡椒碱的含量及RSD值，结果表明，重现性较好，平均值0.35 mg/mL，RSD值为1.19%。

2.3.9 回收率试验 取已知含量(0.345 mg/g)的如意珍宝片(批号: 20190801)6份，研细,每份约0.5g，精密称定，分别加入胡椒碱对照品溶液(0.1 mg/mL)3.0 mL，按照“2.3.3”项下处理方法，制成供试品溶液，再按照“2.3.1”项下的色谱条件，依法测定，供试品中羟基红花黄色素A的加样回收率的RSD值为 1.67%，表明本法回收率良好。结果见表5。

表5 回收率试验数据

2.3.10 样品中胡椒碱的含量测定 取10批样品(批号：170301、181109、190401、190801、190903、191001、191002、191003、191101、191102)，每批2份，按照“2.3.3”项下处理方法，制成供试品溶液，精密吸取供试品溶液20μL，按照“2.3.1”项下的色谱条件，依法测定，记录峰面积、计算样品中胡椒碱的含量，结果见表6。

表6 样品中胡椒碱的含量测定数据

续表6表6 样品中胡椒碱的含量测定数据

3 讨论

3.1 薄层色谱研究 通过文献[2-19]查阅，本研究采用TLC法对如意珍宝片中的乳香、降香、丁香、木香的进行了鉴别，结果色谱斑点清晰、分离度良好，且阴性无干扰；可有效控制如意珍宝片的质量。其余药材(如檀香、藏木香、香旱芹等)因为处方药材数量较多，阴性干扰尚无法消除，待进一步研究。

3.2 含测药材的筛选 研究前期，参照《中国药典》2015年版一部，采用HPLC法对高良姜、木香、藏木香等做了含量测定，结果发现，以高良姜中的高良姜素、木香中的木香烃内酯和去氢木香内酯、藏木香中的土木香内酯和异木香内酯作为检测指标时，阴性样品在与对照品相同的保留时间上出现小峰干扰，经反复试验，调整溶剂、流动相比例和检测波长等方法，均不能消除阴性干扰，故不可作为含量测定指标。而红花药材处方含量相对较大，有效成分明确，故参照相关资料[20-29]，采用HPLC对该指标做了专属性试验，结果发现样品和对照品的分离度较好，且阴性在选定的色谱条件下无干扰。由此建立了处方中羟基红花黄色素A的含量测定方法。处方中荜茇具有较好的止痛作用[2-3]，故参照《中国药典》2015年版一部“荜茇”项下采用外标法测定其有效成分胡椒碱的含量，但由于如意珍宝片中化学成分较多，胡椒碱出峰时间较早，基线不平。经反复试验并改进方案(流动相和检测波长)，最终建立了处方中荜茇的主要有效成分胡椒碱的含量测定方法。

3.3 羟基红花黄色素A提取溶媒、提取方法的选择

3.3.1 提取溶媒的选择 资料显示羟基红花黄色素A为亲水性成分，在水和低浓度的醇中溶解度较大；本研究先后采用纯水，25%甲醇、25%乙醇、38%甲醇、50%乙醇作为溶媒进行提取，发现用纯水、38%甲醇、25%乙醇以及50%乙醇做提取时，样品中红花黄色素A的溶解度均较大，但不利于样品滤过，当采用25%甲醇时红花黄色素A的溶解度大且过滤相对容易。故确定以25%甲醇为溶媒。

3.3.2 不同提取方法对处方中羟基红花黄色素A含量的影响 本研究发现采用25%甲醇回流提取和超声提取(30 min)方式，对样品中羟基红花黄色素A的含量基本一致，故选择相对便捷的超声提取方法对样品进行处理。

3.4 胡椒碱提取溶媒、提取方法的选择

3.4.1 提取溶媒的选择 资料[10-15]显示胡椒碱为醇溶性成分，难溶于水易溶于醇。本研究先后采用甲醇、无水乙醇，95%乙醇作为溶媒进行超声(30mim)提取，试验发现甲醇、无水乙醇，95%乙醇均能提取出胡椒碱，但甲醇对样品中胡椒碱的溶解度最大，故确定以甲醇为溶媒。

3.4.2 不同提取方法的选择 以甲醇为溶剂，采用回流、超声、振揺三种提取方式将样品提取30 min。经HPLC检测后发现：振揺提取的效率最低；甲醇回流提取略大于超声提取样品中胡椒碱的含量。但为了提高工作效率，节省检验时间，本研究选用超声处理的方法对样品进行提取。

3.5 不同色谱柱的比较 采用3种不同厂家生产同型号的色谱柱(依利特、安捷伦、菲罗门)，按照各自色谱条件分别对胡椒碱和羟基红花黄色素A进行检测，样品分离效果及含量无明显差异。

4 结论

如意珍宝片中乳香、降香、木香、丁香的TLC斑点清晰，且阴性无干扰，可作为薄层鉴别项下的质量标准。根据HPLC含量测定结果，如意珍宝片中羟基红花黄色素A的含量在0.37 mg/g～0.755 mg/g的范围内，胡椒碱的含量在0.26 mg～0.37 mg的范围内。故暂定本品中每1 g含羟基红花黄色素A应不得少于0.3 mg，含胡椒碱应不得少于0.20 mg。