人气道平滑肌原代细胞不同提取方法对比

黄兰芳 黄青华 李梦泽 侯长春 闫萍

支气管哮喘是一种表现为可逆性呼气困难的气道慢性炎症[1]，其后期亦有不可逆呼吸困难出现，气道重塑是哮喘中出现不可逆呼气困难的原因之一[2，3]。气道重塑与气道平滑肌有关，气道平滑肌的增生、肥大以及基膜增厚均使哮喘患者哮喘发作时出现不可逆呼气困难，给支气管哮喘的治疗增加难度[4～6]。故气道平滑肌的培养及研究对探究支气管哮喘有重要的作用。本研究通过探讨两种不同方法培养气道平滑肌细胞，观察其生长特点并对比两种方法的利弊，为后续细胞实验做准备。

1 材料与方法

1.1 实验材料新鲜人支气管组织、灭菌后pH 为7.2～7.4 的PBS（雷根生物）、高糖DMEM（Gibco）、胶原酶I（赛默飞）、胎牛血清（以色列BI）、青霉素-链霉素（BI）、含0.25%EDTA 胰蛋白酶（索莱宝），α-actin 抗体（美国CST），FITC 荧光二抗（索莱宝）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 经与患者签署知情同意书后，取我院胸外科2019年3～10月行肺叶切除术肺癌患者的正常肺叶、段支气管标本。将正常肺叶、段支气管切下后立即放入已加双抗的冰冷PBS 中，用冰盒运送至实验室。在超净台中用已加双抗的冰冷PBS 反复清洗支气管组织3～5 遍，用无菌手术刀将支气管表面的结缔组织刮除，眼科剪剪开支气管，手术刀轻轻刮除内面内皮组织，小心剔除软骨、外膜及内皮组织。然后将支气管转移至干净灭菌的5ml 离心管，用眼科剪将组织剪碎，剪成1mm3左右大小的组织块。将每例标本剪碎的组织块平均分成2 份，分别用组织块贴壁法和酶解离法进行细胞培养，并计算成功率和污染率。成功率为成功培养出气道平滑肌细胞的例数/总例数×100%；污染率为污染的例数/总例数×100%。

1.2.2 组织块贴壁法 在剪碎的支气管平滑肌组织中加入一滴血清，用眼科镊均匀（每个小块组织相隔0.5～1cm）平铺于25ml 灭菌培养瓶底面，放置好组织块后，轻柔翻转培养瓶，使培养瓶底部朝上，然后置于37℃ 5%CO2培养箱中培养，组织贴壁5～10h后，在无菌条件下沿着侧壁向培养瓶内加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 5ml，并翻转瓶底。继续放入培养箱中培养，每3～5 天换一次液。每次换液均应轻柔操作，切勿使组织块移动。

1.2.3 酶解离法 在装有剪碎的支气管平滑肌组织的离心管中加入2ml 双抗高糖DMEM，加入胶原酶I，使其最终浓度为0.1%，封口胶封口，置于37℃5%CO2培养箱中消化3h，然后加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 2ml 终止消化，1 000r/min 离心5min，去上清，加入新鲜含10%胎牛血清的高糖DMEM 5ml，转移至25ml 灭菌培养瓶中，置于37℃ 5%CO2培养箱中培养，3 天内切勿移动此培养瓶。每3～5 天换一次液。

1.2.4 细胞传代纯化 倒置相差显微镜下观察，组织周围融合细胞达80%时可用胰蛋白酶消化法传代。用吸管吸出原培养液，培养瓶中细胞用灭菌双抗PBS 清洗2 遍，加入含0.25%EDTA 胰蛋白酶1ml，在室温下消化1～2min，显微镜下观察可见细胞由梭形变为圆形，边缘透亮，并从瓶壁上脱离出来，轻晃瓶身，见大部分细胞从瓶壁上脱落后，加入含1ml 10%胎牛血清的高糖DMEM 终止消化，用吸管轻轻将残存在瓶壁上的细胞吹打下来，将混合液转入离心管中，1 000r/min 离心5min，去上清，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 后分装至2～3 个新灭菌培养瓶中，置于37℃ 5%CO2培养箱中继续培养。

1.2.5 细胞鉴定 形态学观察：倒置相差显微镜观察细胞形态、大小、生长特点及排列方式。细胞免疫荧光鉴定细胞内α-actin：取出1 瓶3～4 代细胞，胰酶消化后分别接种至放置已灭菌盖玻片的6 孔板中，每孔约105个细胞，待细胞贴壁后，吸掉培养液。用37℃预热的PBS 于摇床清洗3 次，每次5min。使用4%多聚甲醛液在室温下固定细胞15min。再用37℃的0.1% TritonX-100 溶液透化处理5min 后，用PBS 于摇床清洗细胞3 次，每次5min。用2%BSA室温封闭20min 后，用PBS 于摇床清洗细胞3 次，每次5min。取适量配置好的α-actin 单克隆抗体工作液，以覆盖住玻片上的细胞为宜，4℃过夜。第2 天用PBS 于摇床清洗细胞3 次，每次5min。FITC室温避光孵育1h 后用PBS 于摇床清洗细胞3 次，每次5min。使用含DAPI 溶液的抗荧光淬灭剂对细胞核进行复染，封片后于荧光显微镜下拍照。

2 结果

2.1 细胞培养组织块贴壁法5～7 天可见有圆形小细胞爬出，细胞贴壁生长，15～20 天生长至融合，约20天铺满瓶底80%以上，此时可以首次传代（见图1）。酶解离法7～10 天可见细胞增多融合，用胰蛋白酶消化法重铺细胞后3～5 天可传代（见图2）。15 例标本两种方法原代培养均成功，成功率100%，污染率为0。组织块贴壁法培养出的细胞能稳定传代至8～10 代；而酶解离法细胞能传代至第7 代，到第8 代时细胞形态学开始发生改变。

图1 组织块贴壁法（200×）

图2 酶解离法（200×）

2.2 细胞形态学和免疫荧光染色结果倒置相差显微镜观察两种方法培养的原代细胞，细胞呈长梭形、纺锤形或者不规则三角形，有1～2 个细胞核。细胞呈“峰-谷”生长（峰：细胞呈多层细胞丘；谷：即单层细胞处，甚至无细胞处）。见图3A。α-actin免疫荧光染色显示，两种方法培养的原代气道平滑肌细胞95%以上呈强阳性染色，胞浆呈绿色，胞核呈蓝色。见图3B。

图3 细胞形态和免疫荧光染色

3 讨论

许多慢性气道炎症后期会出现气道重构，导致肺功能下降，而气道平滑肌的改变在呼吸道炎症及气道重构的发生、发展过程中具有重要作用。罗雅玲等[7]认为气道平滑肌是慢性呼吸道疾病中研究价值较高的组成部分，为增加实验研究的实用性，需培养人气道平滑肌。然而人气道平滑肌细胞存在油脂多、贴壁难的特点，且其对无菌环境、培养条件要求高，故现有研究中多用小鼠、大鼠或豚鼠的气道平滑肌进行原代培养。本研究提供了人气道平滑肌原代细胞培养的方法及对比，为后续细胞实验提供基础。α-actin 是一种具有收缩能力的微丝蛋白，广泛分布于几乎所有的肌型细胞中。α-actin蛋白主要用于检测骨骼肌、平滑肌、血管平滑肌、心肌和肌原性肿瘤。Actin（肌动蛋白）是在所有真核细胞中都表达的高度保守的蛋白质，也是标记平滑肌和肌上皮细胞肿瘤的有效工具。

人气道平滑肌细胞原代分离培养技术主要有组织块贴壁法和酶解离法[8，9]。本实验使用两种方法均能培养出特异性好、污染率低、纯度高的人气道平滑肌细胞，但培养出细胞的生长速度有明显差异。组织块贴壁法培养周期较长，但是细胞形态稳定，活力比酶解离法好，并且原代培养细胞的成功率高。酶解离法培养周期短，虽然也能成功提取原代细胞，但是细胞形态学不稳定，对细胞的活力有一定影响，并且胶原酶价格昂贵。因此我们认为组织块贴壁法值得推广使用。此外，本实验有几个需要注意的细节：①在手术室中取下患者的气管组织后需立即放入无菌并加了青霉素-链霉素的冰冻PBS 中，用冰盒运送至实验室，最大程度保持气管组织的活性。②实验室内于超净台上完成后续步骤。全程尽可能保持无菌操作。用手术刀操作时，动作轻柔但需尽量清除结缔组织和内皮细胞，减少后续细胞的纯化时间，眼科剪剪碎支气管组织时可按需求剪至合适大小，一般以1mm3为佳。使用组织块法进行贴壁时，可向剪碎的支气管平滑肌组织中加入一滴血清，增加其粘附性；因人气道平滑肌存在油脂多的特点，较难贴壁，可将贴壁时间适当延长（4～10h），其后再加培养基进行培养。③原代培养时，前3～5 天要求培养瓶绝对静置，不可移动。④传代时，细胞与胰蛋白酶作用的时间一般1～2min即可，时间太长对原代细胞造成损害，后续恢复原状的时间会延长甚至恢复不了正常的梭形形态。离心后去上清时需小心用吸管吸出上清，避免浪费原代细胞。