黄连素对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药性的体外逆转作用

李永伟 许晓娜 刘心伟 张小倩 王志盛 赵芝静 王春霞

我们前期研究发现产KPC 酶是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的最主要耐药机制[1]，目前发现的KPC 酶有KPC1～19 共19 种，其中KPC-1 和KPC-2 完全相同，故KPC-1 名称不再使用，其中在我国最为常见的是KPC-2，编码KPC 的基因多位于Tn1721 的Tn3 型转座子上，有的位于染色体或者质粒上，可以在革兰阴性同属和不同属细菌之间进行垂直或水平传播，从而导致耐药性的广泛播散。在传播过程中，质粒作为载体起着重要作用，质粒是细菌除染色体外独立遗传物质，存在于细胞质中，常为闭合环状的双链DNA，能够自主复制，根据其传播耐药性的方式，分为可在细菌间进行接合转移的R 质粒，以及只能通过噬菌体转导传播的R质粒，在革兰阴性菌中，以R 质粒多见，常能传播数种抗菌药物的耐药性。

黄连素有很好的抗菌活性，对临床分离的CRKP具有一定的抑菌作用，但其具体作用机制尚不清楚，对黄连素是否能够消除CRKP 携带耐药的R 质粒，从而恢复其对常用抗菌药物敏感性的相关研究较少。本研究选择我院临床微生物室2014年1月～2017年8月分离的82 株CRKP 中耐药基因为KPC 且测序完整菌株19 株进行进一步的质粒接合转移试验，探讨接合性R 质粒的存在，并将黄连素作为质粒消除剂进行质粒消除实验，观察作用效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验菌株选择我院临床微生物室2014年1月～2017年8月分离的82 株CRKP 中耐药基因为KPC且经测序确认的19 株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌作为实验菌株，选取20 株碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌菌株作为对照，实验菌株做质粒接合转移实验，受体菌为对叠氮钠耐药的J53 大肠埃希氏菌（E.coli J53），由浙江大学附属儿童医院周明明老师惠赠。

1.2 主要设备及耗材涡旋混合器（德国Thermo）、Precisa XT220A 分析天平（瑞士Precisa）、NS-100B摇床（上海皓庄）、高压灭菌锅（YXQ-LS-100SII，上海博迅）、黄连素注射液（山西芮添）、MH 琼脂（英国Oxoid）、MH 肉汤（英国Oxoid）、酵母提取物（英国Oxoid）、十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS，华美生物）、美罗培南标准品（100mg/支，中国食品药品检定研究院）。

1.3 黄连素对肺炎克雷伯菌临床分离株的MIC 测定按照《全国临床检验操作规程》（第4 版）[2]推荐的微量肉汤稀释法进行以下实验：①取7 个灭菌玻璃试管，做好标记，在第1～6 管中各加入1ml 之前配制好的MH 肉汤，第7 管加入2ml MH 肉汤作为阴性对照；②吸取1ml 10mg/ml 的黄连素原液缓慢加入第1 管，用移液器枪头小心吹打混匀，然后从第1管中吸取1ml 溶液加入第2 管，再次小心吹打混匀，从第2 管中吸取1ml 溶液加入第3 管，以此类推直至第5 管，第5 管内的2ml 混合液吹打混匀后弃去1ml，第6 和第7 管中不添加药物，第1～5 管中的中药终浓度依次为5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/ml；③挑取适量隔夜培养的CRKP 纯菌落，加入NaCl 浓度为0.45%上机专用生理盐水配制0.5 麦氏浊度的菌悬液，再加入MH 肉汤进行100 倍稀释，最后吸取1ml 稀释过的菌悬液加入上述第1～6 管中，加盖灭菌试管塞，在CO2培养箱中37℃孵育24h，孵育结束后用接种环转种至哥伦比亚血平板，过夜培养，在经过倍比稀释后，仍然无细菌生长的中药浓度作为其MIC。

1.4 质粒接合转移试验①供体菌和受体菌活化和再活化：以KPC 阳性的CRKP 为供体菌，临床分离全敏感高毒力肺炎克雷伯菌（Kpn）为受体菌；选取40ml 经过高压灭菌的三角小烧杯，提前加入10ml LB 肉汤，在哥伦比亚血平板上挑取上述菌株单个菌落，加入小烧杯，用无菌纱布密封后放入摇床，设定恒温37℃，转速设定为120r/min，活化14h；培养结束后取100μl 上述培养物和10ml LB 肉汤混匀（稀释比例1∶100），放入摇床37℃，120r/min 继续培养4h 进行再活化。②供受体菌接合及接合子筛选：质粒接合转移试验的具体程序参照刘心伟等[3]方法，取上述活化后供受体菌按照4∶1（0.1ml CRKP，0.4ml 高毒力Kpn）的比例加入含有10ml LB 肉汤的灭菌三角小烧瓶中，无菌纱布密封，放置37℃隔水恒温培养箱中，培养12h；使用之前配制好的中国蓝选择培养基（含2μg/ml 的MEM）作为接合子筛选平板，此平板CRKP 和接合子均可生长，但所选CRKP 为粗糙型菌落，接合子为饱满光滑型菌落，从形态上可将两者区分，如果仅有粗糙型菌落生长，则视为实验失败。吸取20μl 的接合混合物稀释10 倍后接种至含药的中国蓝筛选平板上，37℃恒温培养24h，观察有无菌落生长，并对接合子常规鉴定，用E-test 法测得其对IPM 的MIC。

1.5 黄连素对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌R 质粒的体外消除试验参照刘心伟等[3]的质粒消除实验进行，选取1%的十二烷基硫酸钠（SDS）作为阳性对照。

1.5.1 菌悬液配制 取15ml 无菌试管，加入5ml LB肉汤，挑取质粒接合转移试验阳性的6 株CRKP 单个菌落，于恒温摇床中35℃，120r/min，隔夜增菌培养，再活化4h 后，用上机专用生理盐水配制3.0 麦氏浊度菌悬液（细菌浓度约为9×108个/ml）。

1.5.2 消除试验 第1～5 管用LB 肉汤与黄连素倍比稀释不同浓度，第6 管加入1%SDS，第7 管加LB肉汤，第6、7 管作为阳性对照，第8 管只加LB 肉汤作为阴性对照，第1～7 管加入菌悬液共同培养24、48、72h，然后用移液器从第1～8 管中吸取10μl，分三区划线接种于哥伦比亚血琼脂平板，培养24h 后，挑取单个菌落约300 个进行平板影印培养，连续影印至普通中国蓝平板和含MEM 2μg/ml 的筛选中国蓝平板，消除子在不含药物的中国蓝培养基能够生长，而在含药物的中国蓝培养基不能生长，计数300 个菌落中消除子的数量，并以消除子数量/300 ×100%计算消除率。

1.6 统计学方法应用SPSS 17.0 统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KPC 阳性CRKP 菌株质粒接合转移试验结果19 株KPC 基因型阳性的CRKP 菌株，其中6 株质粒接合转移试验阳性，占31.58%（6/19）。

2.2 药敏试验结果黄连素对肺炎克雷伯菌的MIC 为0.625～2.5mg/ml，其对不同耐药程度肺炎克雷伯菌的药物敏感性差异无统计学意义（t=1.89，P=0.07），见表1。

表1 黄连素对Kpn 的药物敏感性试验结果（±s）

Kpn 菌株 Kpn 表型 菌株数（n） MIC（mg/ml）敏感菌株 IPM（S） 20 1.00±0.59耐药菌株 IPM（R），KPC（+） 19 1.38±0.72

2.3 黄连素对KPC 阳性CRKP 的R 质粒消除试验结果黄连素对6 株试验菌株在24、48 和72h 的R质粒消除率分别为0、3.1%和4.7%；1%SDS 在24h、48h 和72h 的R 质粒消除率分别为1.1%、4.0%和8.1%；空白对照所有时间段质粒消除率均为0，从而排除质粒在复制中自行丢失的可能性。见表2、3。

表2 黄连素对KPC 阳性CRKP 菌株的R 质粒消除率（%）

表3 1%SDS 对KPC 阳性CRKP 菌株的R 质粒消除率（%）

3 讨论

典型肺炎克雷伯菌为革兰染色阴性，菌体粗短，两端较平。镜下呈现单个、成对或者短链状。细胞外有荚膜多糖，在宿主体内因为营养丰富荚膜尤为明显，无芽孢及鞭毛，多数有菌毛。肺炎克雷伯菌抵御外界能力强，对抗菌药物容易产生耐药性，具有O 和K 两种抗原，分别属3 型和12 型。55℃时，30min 即能使细菌灭活，在培养基上可存活数月。其营养类型为兼性厌氧，营养要求低，在普通培养基上即能形成较大的灰白色粘液菌落。该细菌能耐受胆盐环境，在含胆盐的选择性培养基上生长，培养24h 形成大菌落，48h 易融合成片，形成胶水样菌苔。少数肺炎克雷伯菌可生长为粗糙型菌落。在血琼脂平板上无溶血和特殊气味产生。在肠道杆菌选择性培养基上因为可发酵乳糖，从而呈现有色菌落。肺炎克雷伯菌细菌氧化酶阴性，触酶阳性，大多数菌株可利用枸橼酸盐，多数菌种的尿素酶阳性或者迟缓阳性；V-P 试验阳性；发酵葡萄糖产酸产气，均能发酵侧金盏花醇；ONPG 均为阳性。不产生硫化氢，也不产生苯丙氨酸脱氨酶及DNA 酶。可利用肌醇、鼠李糖及蔗糖作为唯一碳源，也可利用乳糖和山梨醇。不水解葡萄糖醛酸苷，不产生色氨酸脱氨酶及组氨酸脱氨酶。

肺炎克雷伯菌可定植在人体胃肠道以及鼻咽部，常引发多部位感染。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药率较高，相关文献报道CRKP 引发败血症的病死率可高达48%[4]。由于广谱抗菌药物的不合理应用，耐药菌株比例不断增加，临床治疗效果差[5]。

近年来，中药抗感染成为研究热点，传统中药抗菌效果好，副作用小，且价格低廉，不易产生耐药性，深受研究者青睐，在阅读大量相关文献后，本研究选取黄连素作为试验药物。黄连素根据提取物不同可分为硫酸小檗碱和盐酸小檗碱，为黄连的主要成分，分子量为336，属于异喹啉类生物碱，其价格低廉、容易取得、抗菌谱广[6]。中国药典记载黄连能够抗菌消炎，有文献报道它能够作用于大肠埃希菌的多个位点，并且不产生诱导抗药[7]。研究表明黄连素能够消除质粒、抑制细菌RNA、抑制蛋白质以及脂质的生物合成和糖酵解，阻止细菌细胞壁粘肽的合成，甚至直接破坏细菌超微结构[8]。另外还能够调节机体的免疫系统以及改善机体微循环，从而清除病原菌[9]。国内也有学者对其进行体外抑菌试验，证明黄连素对多种常见细菌均具有一定的抑制作用，并且对肺炎链球菌及金黄色葡萄球菌的抗菌作用甚至优于青霉素，若黄连素与其他抗菌药物联合应用效果更好[10]。本研究显示，黄连素对肺炎克雷伯菌具有良好的抗菌效果，MIC 值为0.625～2.5mg/ml，黄连素对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌和碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌的抗菌作用无差异，目前黄连素在临床多应用于肠道菌群的感染，本研究结果提示可以扩大黄连素应用范围，辅助抗菌药物抗菌，可取得良好的抗菌效果，因为抗菌机制本身具有复杂性，不止一个作用位点，因此不易产生耐药性。

传统中药逆转细菌耐药性的途径[11～13]：①消除耐药R 质粒；②抑制主动外排系统；③抑制ESBLs的产生；④抑制耐药基因的表达，其中消除耐药R质粒为主要途径。本研究中，采用不同浓度黄连素作为质粒消除剂，1%SDS 作为阳性对照，另外设置空白对照以排除质粒在传代中自行丢失的情况，作用时间段设定为24、48、72h，通过影印方法计算消除率。虽然黄连素的消除率低于1%SDS，但由于SDS 为化学制剂，是一种能刺激皮肤的表面活性剂，只能用于试验，不能应用于临床，黄连素则是清热燥湿、泻火解毒的常用中药，其对CRKP 中R 质粒有消除作用，能逆转CRKP 耐药性，提高其对抗菌药物的敏感性，降低耐药率，为中药抗感染治疗提供了实验数据。但对不同耐药菌株携带的耐药基因尚未全面研究和评估，这也为后续进一步研究提供了思路。