利用Mintab软件优化燃料乙醇生产发酵条件

陈凡荣，佟 毅，刘海滨，梁春慧

（1.中粮生化能源（肇东）有限公司，黑龙江肇东 151100；2.吉林中粮生化有限公司，吉林长春 130033）

近年来，随着世界性的能源危机日益严重，我国雾霾等环境问题也愈趋严重。燃料乙醇是一种可再生燃料，与石油功能相似[1]；目前，10 多个国家和地区已在使用燃料乙醇，使用最多的是美国、巴西、欧盟和中国。一代乙醇是以玉米等淀粉质为原料发酵制得的可再生能源，已经在能源领域脱颖而出，并越来越显示出广阔和深远的发展前景[5]。

2017 年9 月，国家发改委、国家能源局、财务部等十五部委出台的《关于扩大生物燃料乙醇生产和推广使用车用乙醇汽油的实施方案》规定，2020 年基本实现全覆盖推广使用乙醇汽油，对发展我国燃料乙醇生产和推广使用车用乙醇汽油具有重大意义。按照规划要求，2020年我国所有车用汽油均改为乙醇汽油，当前我国车用汽油表观消费量为1.23亿吨，2020 年我国汽油消费量将达到1.2 亿吨，按10%组分计算，燃料乙醇消费量为1500万吨，是当前消费量的5倍，市场空间巨大。

随着政策的深化实施与技术的进步，中国燃料乙醇工业将迎来激增现象，在保证生产成本的前提下，优化发酵条件，精细化控制，提高原料利用率，是提高企业竞争力的有效手段之一[14]。本试验以燃料乙醇企业现有的工艺情况为基础，利用Minitab17 软件优化燃料乙醇生产的发酵条件，以期实现生产效率的提高。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

试验材料：31%干物液化醪，从燃料乙醇企业生产现场取回；高效糖化酶，酶活力360000 U/mL；市售酸性蛋白酶，酶活力100000 U/mL。

试剂：市售尿素。

1.2 仪器与设备

1260 液相色谱，安捷伦科技发展有限公司；3-18 k 离心机，Sigma 公司；AL20 分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；FiveEasyPlus pH 计，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；ZHWY-2112F 摇床，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3 检测方法

试验组成熟醪的测定：采用高效液相色谱法。

色谱检测条件：流动相：0.005 mol/L H2SO4；预处理柱：伯乐125-0129，30 mm×4.6 mm；色谱柱：伯乐HPX-87H，300 mm×7.8 mm；泵流：0.8 mL/min；柱温：65 ℃；RID 检测器温度：50 ℃；进样量15 μL；运行时间30 min[2]。

2 结果与分析

2.1 发酵条件因素的优化

糖化酶作用于淀粉分子中结合的1，4-糖苷键，从分子长链的非还原端，一个一个地水解为葡萄糖分子，水解后的产物几乎全部生成萄萄糖[4]。发酵前期糖化酶加量过高，水解产生的葡萄糖含量大，会对酵母产生一定的抑制作用[15]，导致发酵酒精度偏低；糖化酶加量过低时不能将糊精类物质完全分解，发酵最终酒精度偏低，残糖含量高[6]。

在酒精发酵过程中，酵母细胞中含氮量虽然不高，只占到2 %左右[9-10]，但是它的作用却非常重要。在发酵过程中添加尿素可为酵母的生长和代谢提供所需的游离氨基氮。大量的研究表明，当游离氨基氮的浓度大于100 mg/L时，酵母菌的繁殖呈直线增长，而超过870 mg/L 时，再增加含氮量也不会对其有明显的影响。因此氮浓度在150～870 mg/L的范围，会直接影响到发酵的速度[12]。

酵母生长的最适pH4.5～5.0；但在此条件下也适宜其他杂菌的生长，当pH 值降到4.2 以下时，酵母仍能继续繁殖，但此时，乳酸菌已停止生长。所以在生产过程中一般将发酵初始pH 值控制在4.0～4.5之间。

酸性蛋白酶是具催化功能的酶，能够水解蛋白质，在酸性条件下具有较高的活性，能水解原料中的缩氨酸键，释放氨基酸[11]。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来促进，从而加速发酵并提高产量。酸性蛋白酶加量过低时，不能将原料中的蛋白质分解以供酵母利用，导致发酵结束酒精度较低；在氮源充足的情况下，原料中蛋白质含量是固定的，酸性蛋白酶加量过高对酒精度的影响作用差异不大[13]。

由于试验因素较多，对所有因子进行交互试验需耗费大量时间和精力，采用Mintab软件辅助设计全因子试验[3]，结合前期试验条件的影响，拟定试验因子为糖化酶加量(最大值1.2 kg/t醪、最小值0.8 kg/t醪)，尿素(最大值4.0 kg/t 醪/、最小值2.5 kg/t 醪)，酸性蛋白酶加量(最大值0.3 kg/t 醪、最小值0.2 kg/t醪)，pH(最大值4.5、最小值4.0)具体设计如表1所示。

表1 实验设计各因素与水平 (kg/t醪)

2.2 实验结果与分析

每个试验组重复两次实验，在发酵结束测定酒精度。具体实验数据见表2。

通过软件计算，得出模型及回归方程，其R-sq=91.04%、R-sq（调整）=86.78%，说明删去所有影响不显著项后的模型结构较好，回归方程具有较好的预测能力。以未编码单位表示的回归方程酒精度（%vol)=15.6159+0.04094 糖化酶+0.04406 尿素+0.03469 酸性蛋白酶-0.00094 pH+0.02781 糖化酶*尿素+0.01219 糖化酶*酸性蛋白酶+0.00781 糖化酶*pH+0.01531 尿素*酸性蛋白酶+0.01969 尿素*pH+0.00156 酸性蛋白酶*pH（图1）。方程的拟合是使用已编码单位进行的，多项式模型方程拟合的性质由确定系数R2表示，R2=0.9125，说明此模型近似的拟合于真实情况，预测值和实测值之间具有高度的相关性，可以解释91.25%实验所得的响应值的变化。

表2 Plaekett-Burman实验设计表及结果

通过效应Pareto 可以看出，试验的关键因子为B、A、C、AB、BD、BC、AC、AD、CD、D，即尿素、糖化酶、酸性蛋白酶、糖化酶×尿素、尿素×酸性蛋白酶、尿素×酸性蛋白酶、糖化酶×酸性蛋白酶、糖化酶×pH值、酸性蛋白酶×pH值、pH值（图1）。

由图1 可以看出，尿素斜率较大，说明其对发酵的影响显著，其次为糖化酶、酸性蛋白酶，pH 值的斜率较为平缓，说明其对发酵的影响较不显著。因子的重要顺序为B＞A＞C＞D（尿素＞糖化酶＞酸性蛋白酶＞pH值）。（图2）

由图2 可以看出，糖化酶与pH 值、尿素与pH值之间存在着一定的交互作用，糖化酶与尿素、糖化酶与酸性蛋白酶、尿素与酸性蛋白酶不存在明显的交互作用关系。（图3）。

通过相应优化器，利用控制方程式对数据进行计算[7-8]，得出最佳操作水平为糖化酶1.2 kg/t 醪、尿素4.0 kg/t 醪、酸性蛋白酶0.3 kg/t 醪、pH 4.5。采用最佳操作水平数据进行试验，以验证发酵结果，通过试验发现，发酵72 h 时，发酵酒精度为15.82%vol，优于其他试验组。如图4所示。

3 结论与展望

使用燃料乙醇企业生产线上的31%干物液化醪进行发酵试验，经过具体实验，糖化酶1.2 kg/t醪、尿素4.0 kg/t 醪、酸性蛋白酶0.3 kg/t 醪、pH 4.5，发酵效果最优，酒精度可达15.82 %vol，乙醇得率提高2%。由于研究方向以及设备仪器的原因，本次实验主要对发酵成熟酒精度进行了比较，并未对发酵后的残总糖、残淀粉等项目进行检测，后续研究将对配料物料粒度分布、液化和发酵参数控制进行综合研究，从而确定更优的燃料乙醇的生产工艺条件，促进酒精发酵的高效发展与进步。