天麻钩藤饮多糖的提取与分离纯化研究

张 鑫，安加文，王文佳，刘思海，蔡远俊，王珊珊，梁建东

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

天麻钩藤饮由天麻、钩藤、石决明(生)、山栀、黄芩、川牛膝、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、茯苓组成，具有平肝熄风、清热泻火、益肾活血的功效，可治疗高脂血症、高血压、脑出血、偏头痛、内耳性眩晕等疾病[1-2]。现代药理研究表明，天麻钩藤饮具有提高机体抗氧化能力，降低血压，抑制心肌重构等作用[3]。天麻钩藤饮发挥降血脂、抗氧化性的药效物质基础尚不明确，但组方药物中多含有多糖类物质。植物多糖具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗衰老、抗肿瘤等作用[4-5]。目前对中医方剂中多糖的研究已成为热点，故本实验对天麻钩藤饮中的多糖进行提取与分离纯化研究，为天麻钩藤饮及天麻钩藤饮多糖的利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

1510酶标仪(Thermo Fisher Scientific)，TD5A-WS离心机(湖南湘立科学仪器有限公司)，PL303分析天平(梅特勒上海有限公司)，HZQ-QB摇床(苏州威尔实验用品有限公司)，电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)，移液枪(大龙兴创实验仪器(北京)有限公司)。

1.2 材料与试剂

1.2.1 试剂 考马斯亮蓝G-250(北京索莱宝科技有限公司，批号：20190315)、牛血清蛋白(爱必信上海生物科技有限公司，批号：JB25)、葡萄糖(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20180530)、无水乙醇(重庆川东化工有限公司，批号：20190101)、磷酸(天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号：20161006)、苯酚(国药集团化学试剂有限公司，批号：20171020)、浓硫酸(重庆川东化工有限公司，批号：20160501)、木瓜蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司，批号：122E021)、盐酸(重庆川东化工有限公司，批号：20190101)。以上所有试剂均为分析纯。蒸馏水(自制)。葡萄糖凝胶G-100(北京索莱宝科技有限公司，批号：20180709)。

1.2.2 材料 天麻、钩藤、石决明(生)、山栀、黄芩、川牛膝、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、朱茯苓，均购买自贵州一品药业连锁有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制 精密称取25 mg葡萄糖至25 mL量瓶中，蒸馏水溶解并定容，摇匀，配得1 mg/mL葡萄糖溶液。精密吸取该葡萄糖溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL于25 mL量瓶中，蒸馏水定容。精密吸取各浓度葡萄糖溶液1.0 mL于干燥试管中，加入1.0 mL 6%苯酚溶液，摇匀，迅速加入6 mL浓硫酸，摇匀，冷却后于490 nm波长处测量其吸光度，以葡萄糖质量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2 天麻钩藤饮粗多糖提取条件优化 分别称取天麻、山栀、黄芩、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、朱茯苓各9 g，钩藤、川牛膝各12 g，生石决明18 g，于烧杯中加水浸泡30 min，再进行煎煮，微沸保持一定时间，煎煮数次，每次加入一定比例水，合并药液，浓缩至适量，加入4倍量无水乙醇，醇沉12 h，离心(4 000 r/5 min)，沉淀干燥即得粗多糖[6]。

(1)料液比。本实验采用煎煮法，故不考虑温度的影响。称取3组复方药物量，分别加入15倍水、20倍水、30倍水煎煮30 min，煎煮完后倒出药液，重新加入15、20、30倍蒸馏水，煎煮3次，合并药液，浓缩至适量，加入4倍量无水乙醇，醇沉12 h，离心，沉淀干燥得粗多糖。

(2)煎煮时间。称取4组天麻钩藤饮药物量，加入20倍蒸馏水煎煮，4组药物分别煎煮20 min、30 min、40 min、50 min，每次煎煮完后倒出药液，重新加入20倍水，煎煮3次，合并药液，浓缩至适量，加入4倍量无水乙醇，醇沉12 h，离心，沉淀干燥得粗多糖。

(3)煎煮次数。称取4组天麻钩藤饮药物量，加入20倍蒸馏水煎煮，将4组药物分别煎煮2、3、4、5次，每次煎煮30 min，每次煎煮完后倒出药液，重新加入20倍水，合并药液，浓缩至适量，加入4倍量无水乙醇，醇沉12 h，离心，沉淀干燥得粗多糖。

1.3.3 纯化粗多糖(酶法去除蛋白质) 称定500 mg天麻钩藤饮粗多糖，分别溶于500 mL蒸馏水中，待其充分溶解后，备用。

(1)酶用量。取6组粗多糖，分别加入0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的木瓜蛋白酶，摇匀，于50 ℃下水浴40 min后，置沸水中水浴5 min，冷却后测其吸光度。

(2)酶解时间。取5组粗多糖，加入0.8%木瓜蛋白酶，摇匀，分别于50 ℃下水浴酶解20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，酶解完成后置于沸水中水浴5 min，冷却后测其吸光度。

(3)酶解温度。取8组粗多糖，加入0.8%木瓜蛋白酶，摇匀，分别于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃温度下酶解40 min。酶解完成后置于沸水中水浴5 min，冷却后测其吸光度。

(4)酶解pH。取8组粗多糖，加入0.8%木瓜蛋白酶，摇匀，调节pH分别为4、5、6、7、8、9、10、11，于50 ℃下水浴酶解40 min后，置沸水中水浴5 min，冷却后测其吸光度。

1.3.4 分离纯化后多糖含量测定 采用苯酚-硫酸法进行测定[7]。

1.3.5 分离纯化后蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝法进行测定[8]。

1.3.6 粗多糖的分离 将天麻钩藤饮粗多糖配制成1 mg/mL的溶液，通过SephadexG-100层析柱进行分离，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.8 mL/min，每隔5 min收集一次(每管4 mL)。共收集180管，分别从每管中取200 μL收集液，使用苯酚硫酸法于490 nm下测其吸光度，绘制洗脱曲线。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

以葡萄糖质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，y=14.229x-0.0001，r=0.999，见图1，结果表明在0.02～0.1 mg范围内，葡萄糖的质量与吸光度呈良好的线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 天麻钩藤饮粗多糖提取条件优化

2.2.1 料液比 由图2知，随着煎煮料液比增加，粗多糖质量在料液比1∶15～1∶20之间增加，随后降低。在1∶20时，粗多糖质量最高，达10.65 g。

图2 料液比对粗多糖质量的影响

2.2.2 煎煮时间 由图3可知，随着煎煮时间的增加，粗多糖质量先增加，煎煮40 min时粗多糖质量最高，达10.95 g。当煎煮时间为50 min时，粗多糖质量明显降低。

图3 煎煮时间对粗多糖质量的影响

2.2.3 煎煮次数 由图4知，随着煎煮次数的增加，粗多糖质量先增加，煎煮4次时粗多糖质量最高，达11.2 g，4次后粗多糖质量减少。

图4 煎煮次数对粗多糖质量的影响

2.3 纯化粗多糖(酶法去除蛋白质)

2.3.1 酶用量 由图5可知，当加入的木瓜蛋白酶量为0.8%时，蛋白质的去除率最高，而多糖的剩余率也最高，故最佳酶用量为0.8%。

图5 酶用量对酶法脱蛋白效果的影响

2.3.2 酶解时间 由图6可知，当酶解时间为60 min时蛋白质的去除率略高于酶解50 min时的蛋白质去除率，但在50 min时的多糖剩余率要略高于酶解时间为60 min时的多糖剩余率，研究时主要考虑减少多糖的损耗，综合考虑，最佳酶解时间为40 min。

2.3.3 酶解温度 由图7可知，温度差别对于多糖的损耗影响不大，而在50 ℃时蛋白质的去除率最高，综合考虑，最佳酶解温度为50 ℃。

2.3.4 酶解pH 由图8可知，pH对酶的影响较大，当pH为中性时蛋白质的去除率较高且多糖的损耗较小，综合考虑，酶解最佳pH=7。

图6 酶解时间对酶法脱蛋白的效果影响

图7 酶解温度对酶法脱蛋白效果的影响

图8 pH对酶法脱蛋白效果的影响

2.4 多糖的分离

由图9可知，吸光度在0.15以上的峰有9个，初步从粗多糖中分离得到9种不同组分。

图9 SephadexG-100柱层析分离粗多糖洗脱曲线

3 讨论

多糖是天麻钩藤饮中多数药物的主要成分之一，充分提取和纯化多糖是开发利用天麻钩藤饮的关键。本文通过单因素实验对天麻钩藤饮中多糖的提取及分离纯化进行优化。结果表明，最佳提取工艺为煎煮4次，每次以1∶20的料液比煎煮40 min，此工艺下得到的粗多糖质量最高。酶法去除蛋白质的最佳工艺为加入0.8%的木瓜蛋白酶，pH=7，在50 ℃下反应40 min，此工艺下蛋白质的去除率最高，且多糖的损耗较少。本实验的煎煮液中总糖的含量为77.78%。对多糖的提取和纯化工艺进行优化，可保证在实验时得到最大量的粗多糖，可为后续实验提供足够的原料，避免成本的损耗。吸光度在0.15以上的峰有9个，初步从粗多糖中分离得到9种不同组分。本实验对复方中的多糖进行了提取分离纯化，为今后天麻钩藤饮及天麻钩藤饮中多糖成分的开发利用提供依据。