具有抗稻瘟病菌活性的ⅡW1菌株的分离鉴定及其接合转移方法的建立

李晓华, 冯喆, 黄粤, 马婷婷, 姚家成, 夏珍珍

(中南民族大学 生命科学学院，微生物资源与利用湖北省工程技术研究中心/生物技术国家民委重点实验室，武汉 430074)

水稻是我国乃至世界最重要的粮食作物之一，由子囊真菌引起的水稻稻瘟病[1]，严重影响着水稻等多种农作物的产量[2].目前我国农业生产上多采用化学农药对稻瘟病进行防治，但是长时间的使用化学农药不仅成本高，还会对生态环境造成一定的危害[3,4]，并使稻瘟病菌产生一定的抗药性[5].利用微生物及其代谢产物来防治稻瘟病[6]成为一种经济环保方法[7].

放线菌次级代谢产物中80%的天然活性物质来源于链霉菌，在农业领域，链霉菌次级代谢产物可作为除草剂、抗菌剂、植物生长调节剂等[8,9]，具有见效快、无污染、残留时间短等优点[10].attB位点是链霉菌染色体上的特异性重组位点，利用链霉菌噬菌体ΦC31构建的质粒pSET152，可通过质粒中的attP位点与链霉菌染色体上的attB位点进行特异性重组[11].研究发现，attB/attP位点特异性重组发生交换的核心序列是5′-TT-3′[12].

本文从土壤中分离得到一株具有抗稻瘟病菌的菌株，利用琼脂块法测定该菌株对稻瘟病的抑菌活性，通过形态结构、生理生化和16S rDNA 基因序列同源性比对对ⅡW1菌株进行鉴定；同时对链霉菌ⅡW1菌株attB序列进行克隆，并试图建立接合转移的方法.

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

土壤采自湖北省神农架地区.指示菌稻瘟病菌NO-1菌株和168菌株由中南民族大学生命科学学院微生物实验室保藏.

总DNA提取试剂盒(TaKaRa)；引物合成、基因测序(武汉天一辉远)；参考文献[13]配制高氏Ι号培养基、G+Y培养基、菌丝体培养基、LB培养基、LA培养基、2×YT培养基.

恒温振荡器(THZ-C，太仓市科教器材厂)；电热恒温培养箱(DHP-9162，上海齐欣)；冷冻离心机(TGL-20bR，上海安亭)；分析天平(ALC2100，北京赛多利斯)；电子天平(JA1103N，上海民桥)；PCR仪(C1000Touch，Bio-Rad)；凝胶成像仪(TEL-40，Synoptics)；凝胶成像分析仪(JS-2012，上海培清)；高压灭菌锅(YXQG02，山东新华区医疗器械厂)；超净工作台(SW-CJ-1BU，苏州安泰).

1.2 菌株分离纯化

取土壤样本10 g于三角瓶中，加入90 mL无菌水，30 ℃，180 r·min-1，恒温摇床震荡培养2 h，分别将上述溶液稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同浓度的土壤悬液，用涂布棒均匀涂布在高氏一号培养基上，30 ℃恒温箱倒置培养4 d，经多次挑单菌纯化后，收集生长良好的孢子，-20 ℃保存.

1.3 IIW1菌株抑菌活性检测

利用琼脂块法[14]测定ⅡW1 菌株的抑菌活性，十字测量法测量抑菌圈直径.

1.4 菌种鉴定

提取ⅡW1总DNA[15]，以总DNA为模板，使用16S rDNA通用引物扩增16S rDNA片段.PCR反应条件为：95 ℃，5 min；56 ℃，30 s；72 ℃，30 s；30个循环.将扩增得到的16S rDNA片段测序，序列同源性比对分析，构建16S rDNA系统进化树.结合形态结构和生理生化进行鉴定[14].

1.5 ⅡW1菌株 attB 序列的PCR扩增

以ⅡW1菌株总DNA为模板，PCR反应条件[16]为：95 ℃，5 min；56 ℃，30 s；72 ℃，30 s；30个循环.将扩增链霉菌ⅡW1的attB位点序列测定，序列同源性比对分析.

表1 PCR引物序列

1.6 ⅡW1菌株接合转移

质粒通过两亲接合转移法[17,18]从大肠杆菌ET12567/pUZ8002导入到ⅡW1菌株，30 ℃恒温培养4 d，观察接合转移子的数量.

2 结果和分析

2.1 ⅡW1菌株的分离

以稻瘟病菌NO-1菌株和168菌株为指示菌，以琼脂块检测ⅡW1菌株对稻瘟病菌NO-1菌株和168菌株的抑菌活性，结果由图1可见：ⅡW1菌株对稻瘟病菌NO-1菌株的抑菌圈平均直径为29.7 mm，对稻瘟病菌168菌株的抑菌圈平均直径为27.4 mm.表明ⅡW1菌株稻瘟病菌NO-1菌株和168菌株具有一定的抑菌活性.

1～8)ⅡW1菌株菌块；9,10)琼脂块作为空白对照；a)稻瘟病菌NO-1菌株；b)稻瘟病菌168菌株

2.2 ⅡW1菌株的鉴定

将ⅡW1菌株接种到高氏Ⅰ号培养基上，30 ℃培养4 d，观察到ⅡW1菌株气生菌丝和基内菌丝均呈灰白色.经革兰氏染色、甲基红试验等测定，发现ⅡW1菌株为革兰氏阳性菌株，具有水解淀粉的能力，ⅡW1菌株甲基红检测为阳性.

提取ⅡW1菌株的总DNA，PCR扩增其16S rDNA片段，测序发现该片段长度为1385 bp.在NCBI数据库中对ⅡW1菌株16S rDNA序列进行同源性分析显示，ⅡW1株菌的16S rDNA序列与链霉菌属菌种的16S rDNA序列具有高度的同源性.在MEGA软件中进行多序列比对构建系统进化树，结果发现ⅡW1菌株与Streptomycespseudogriseolusstrain YR-37(KY753277.1)同源性相似度达到98%，初步鉴定ⅡW1株菌属假灰色链霉菌，如图2所示.

图2 ⅡW1株菌16S rDNA序列系统进化树

2.3 假灰色链霉菌ⅡW1菌株的 attB 位点的克隆与分析

以假灰色链霉菌ⅡW1菌株的总DNA为模板，以一对引物attB1/attB2扩增attB位点序列，结果见图3.

)DL2000 Maker；1)假灰色链霉菌ⅡW1菌株attB PCR扩增产物

如图3所示：获得到一条DNA片段，大小为270 bp.测序结果表明，假灰色链霉菌ⅡW1菌株的attB位点序列长度为245 bp.

将假灰色链霉菌ⅡW1菌株的attB位点序列放入NCBI数据库中，比对结果如图4所示，多个小单孢菌和链霉菌的attB位点序列与假灰色链霉菌ⅡW1菌株的attB位点核心序列相似性较高，整个序列核心区高度保守，假灰色链霉菌ⅡW1菌株的attB位点核心序列中有发生位点特异性重组的5′-TT-3′序列，表明假灰色链霉菌ⅡW1菌株染色体上含有attB位点.

2.4 假灰色链霉菌ⅡW1菌株与大肠杆菌的接合转移

为确定可用于假灰色链霉菌ⅡW1菌株进行遗传操作的筛选标记，检测了ⅡW1菌株对氯霉素、卡那霉素、阿泊拉霉素和萘啶酮酸几种抗生素的抗性水平，结果显示：在1～30 μg·mL-1氯霉素范围内，ⅡW1菌株正常生长；当氯霉素浓度达到 40 μg·mL-1时，ⅡW1菌株不生长；卡那霉素、阿泊拉霉素浓度为1 μg·mL-1时，ⅡW1菌株就不能生长；浓度为40 μg·mL-1的萘啶酮酸对ⅡW1菌株的生长无影响.表明链霉菌ⅡW1菌株对卡那霉素、阿泊拉霉素敏感，对萘啶酮酸不敏感.

根据质粒pSET152具有阿泊拉霉素抗性基因的特性，将供体大肠杆菌ET12567(pUZ8002)菌株与假灰色链霉菌ⅡW1菌株菌丝体混合，涂布在平板上，30 ℃恒温培养14 h，以阿泊拉霉素覆盖作为抗性筛选标记覆盖于平板上，在30 ℃恒温培养箱中培养5 d，可得到对阿泊拉霉素具有稳定抗性的假灰色链霉菌ⅡW1菌株的接合转移子.以接合转移子总DNA为模板，使用引物attL-F,attL-R扩增，结果如图5所示，得到一段大小为353 bp的片段，以假灰色链霉菌ⅡW1菌株原始菌株总DNA为模板，PCR扩增无法得到相同片段，则表明质粒pSET152可以通过接合转移整合至假灰色链霉菌ⅡW1菌株的染色体上.

图4 假灰色链霉菌IIW1菌株attB位点序列比对

M)DL2000 Marker；1)假灰色链霉菌ⅡW1菌株PCR产物；2)假灰色链霉菌ⅡW1菌株的接合转移子PCR产物

3 讨论

链霉菌的次级代谢产物是一类非常重要的微生物资源，在稻瘟病的生物防治方面具有很大潜力.本文从湖北省神农架地区土壤中筛选出一株抗稻瘟病菌的ⅡW1菌株，研究表明，ⅡW1菌株对稻瘟病NO-1菌株及稻瘟病168菌株具有较强的抑菌作用，抑菌圈直径分别为29.7 mm和27.4 mm.文献报道S.vinaceusdrappus、S.philanthiRM-1-138、S.griseofuscus、S.hygroscopicus、Streptomycessp.339、S.flavotricini、S.sysdeneusis263[19]、S.globisporusJK-1[20]都表现出一定的抗稻瘟病活性.但目前具有抗稻瘟病活性的假灰色链霉菌尚未发现有文献报道.PCR扩增得到ⅡW1菌株16S rDNA片段大小为1385 bp，对序列进行生物信息学分析，发现ⅡW1菌株的16S rDNA基因与假灰色链霉菌的同源性在98%以上，初步鉴定ⅡW1属于假灰色链霉菌.链霉菌ⅡW1菌株的attB位点序列长度为245 bp，对序列分析发现假灰色链霉菌ⅡW1菌株的attB位点中核心序列是5′-TT-3′，位点的序列比对结果表明，假灰色链霉菌ⅡW1菌株的attB位点与多个小单孢菌和链霉菌的attB位点同一性较高，其中与StreptomycesrimosusR7的位点同一性高达96%以上.

选用阿泊拉霉素为假灰色链霉菌ⅡW1菌株接合转移的抗性筛选标记，根据pSET152质粒的特性，将假灰色链霉菌ⅡW1菌株与大肠杆菌进行属间接合转移，获得接合转移子，该转移子是具有阿泊拉霉素稳定抗性的假灰色链霉菌ⅡW1菌株.结果表明，通过接合转移可以将质粒pSET152整合到假灰色链霉菌ⅡW1菌株的染色体上.