外源褪黑素对高温胁迫下甜瓜幼苗抗氧化特性及其相关基因表达的影响

周永海，杨丽萍，马荣雪，董亚萍，张 显，马建祥，李 好，魏春华，杨建强，张 勇

(西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨凌 712100)

高温胁迫影响着农作物正常的生长发育，随着全球气候变化，气温不断升高，高温胁迫是限制全球农作物生长的主要因素之一[1-2]。高温胁迫对植物的伤害主要包括活性氧引起的氧化应激、蛋白质变性、酶失活、膜脂过氧化和核酸(DNA和RNA)损伤。植物已经进化出了防御系统，这些系统配备了不同的抗氧化成分来清除过量产生的活性氧从而保护植物免受氧化损伤。这些系统的重要的酶是抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)[3-4]。除此之外，植物通过增加相关基因的表达从而保护植物免受伤害。一般来说，高温胁迫导致了几种热诱导基因的上调，这些基因通常被称为“热休克基因”(HSPS)，编码热休克蛋白，这些活性产物对于植物在致命的高温下生存是非常必要的[5]。高温诱导的这些蛋白的表达大多通过蛋白折叠保护细胞内蛋白不变性，保持其稳定性和功能[6]。HSP可分为5个不同的基因家族，包括HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和HSP20。总之，植物通过提高这些酶的活性和抗逆基因的表达，维持体内自由基产生与清除间的动态平衡，从而使植物免受逆境伤害。

褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)，是高度保守的并广泛存在于植物体内。1958年，Lerner 等[7]首次从牛的松果体中提取出褪黑素，并证实它是一种类激素物质，参与动物的生长、发育调控和信号转导，褪黑素是一种具有较强抗氧化作用的内源性自由基清除剂。由于其高亲脂性，可轻易通过生物膜，可作为细胞内自由基清除剂。褪黑激素由于其部分亲水性，可以通过细胞质进入细胞核，发挥抗氧化作用[8]。试验表明，褪黑素可以直接清除·OH、H2O2、ONOO-、NO、LOO·等自由基[9]。

甜瓜是重要的经济作物之一，近年来，甜瓜产业发展较快，是效益较好的经济作物[10]。但夏秋季设施栽培中高温往往是制约甜瓜设施栽培的主要限制因素。因此，本试验通过预试验确定适宜的褪黑素处理浓度，研究适宜浓度的外源褪黑素在高温胁迫下甜瓜生理生化指标的变化特性，探讨外源褪黑素诱导甜瓜幼苗耐热性的可能机理，为夏秋季甜瓜设施栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验设计

试验于2019年3月至7月在西北农林科技大学园艺学院进行，供试品种为‘农大甜5号’，种子由西北农林科技大学园艺学院西甜瓜课题组提供。选取饱满、大小一致的甜瓜种子，置于 28 ℃人工气候箱内恒温催芽12～24 h，种子露白后，播种于50孔穴盘育苗。置于RXZ智能型人工气候箱(宁波江南仪器厂制造)，培养条件为；昼14 h(32 ℃)/夜10 h(20 ℃)光照度为8 000 lx，相对湿度为80%，待幼苗长至2片真叶时将幼苗移栽至营养钵(10 cm×10 cm)中，每隔2 d浇1次1/4 Hoagland营养液，每钵用量为20 mL。当幼苗长至三叶一心时挑选生长一致的幼苗进行处理，常温下喷施蒸馏水作对照(CK)、高温下喷施蒸馏水(HT)和高温下喷施150 μmol/L的褪黑素(MTHT)。每个处理15株共重复3次，连续喷施3 d(以叶面欲滴又不滴水为宜)，然后在人工气候箱内(光周期36 h，光照度8 000 lx)进行 43±1 ℃高温处理，同时设置32 ℃的常温对照(对照除与高温处理温度不同外，其余条件均一致)。处理36 h后统计热害指数，并采集幼苗功能叶片和根(储存于-80 ℃超低温冰箱中)进行各种生理指标的测定。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 热害指数的统计 热害指数分级参照邓娇燕等[11]的方法，受害级别：0 级，生长正常，未受伤害；1 级，仅少数叶片边缘有轻度的褶皱萎缩；2级，半数以下的叶片萎蔫死亡；3 级，半数以上的叶片萎蔫死亡；4 级，植株全部死亡。

热害指数=∑[各株级数/(最高级数×总株数)]×100%

1.2.2 鲜质量含水量和根系活力的测定 每个处理随机选取10株幼苗，用去离子水冲洗干净，称其鲜质量，然后将幼苗烘干至恒量，称其干质量，鲜质量含水量=100×(鲜质量-干质量)/鲜质量×100%。根系活力采用TTC法测定[12]。

1.2.4 活性氧和抗氧化相关指标的测定 超氧化物歧化酶(SOD)采用氮蓝四唑(NBT)还原法测定[15]，过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚显色法测定，过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外分光光度法测定。根据Wang等[16]方法测定抗坏血酸过氧化物酶(APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR) 活性。

1.2.5 RNA提取及荧光定量PCR分析 叶片总RNA用试剂盒(RNAsimple Total RNA ，Tiangen， Beijing)提取，总RNA反转录用(FastKing cDNA First Chain Synthesis Kit)试剂盒进行，得到cDNA模板。用Primer 6设计软件设计qRT-PCR特异性引物，以甜瓜actin作为内参基因。特异性引物序列如表1所示。使用IQ5实时定量仪(Bio-rad, 美国)进行荧光定量分析，定量试剂盒选用SYBR○RPremix ExTap TMⅡ (2×)试剂盒(Takara, Tokyo, Japan)扩增PCR。反应体系中包含SYBR荧光染料10 μL， cDNA 模板0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX 0.2 μL最后用ddH2O补充至20 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s、58 ℃退火 20 s、72 ℃延伸20 s，循环40次。

1.2.6 数据统计分析 采用GraphPad Prism软件作图，采用 SPSS 21.0 统计软件分析数据，多重比较采用Duncan’s检验(P<0.05显著水平)。图表数据均为3次重复的平均值。

2 结果与分析

2.1 外源褪黑素对高温胁迫下甜瓜幼苗含水量和热害指数的影响

在高温处理前3种处理的甜瓜幼苗形态一样，高温处理36 h后，与CK相比HT和MTHT鲜质量含水量均下降，分别下降5.09%和 2.21%，各处理之间差异显著。高温胁迫后，与CK相比HT和MTHT热害指数均升高，但MTHT较HT热害指数降低44.14%，MTHT明显地缓解了高温对植物生长的抑制作用 (表2)。

表1 荧光定量PCR扩增引物Table 1 Primers for fluorescence quantitative PCR amplification

表2 外源褪黑素处理及高温胁迫下甜瓜幼苗含水量和热害指数Table 2 Relative water content and heat damage index of melon seedlings under exogenous melatonin and high temperature stress

注：数值代表“平均值±标准差”。同列不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:Each value represents the “mean±standard deviation”.The different lowercase letters in same column indicate significant difference(P<0.05).

2.2 外源褪黑素对高温胁迫下甜瓜幼苗根系活力的影响

由图1可以看出，高温胁迫36 h后，与CK相比，MTHT甜瓜幼苗的根系活力升高，但差异不显著，HT根系活力下降，HT与MTHT差异显著。

2.3 外源褪黑素对高温胁迫下甜瓜幼苗MDA质量摩尔浓度和产生速率的影响

2.4 外源褪黑素对高温胁迫下甜瓜幼苗SOD、POD和CAT活性的影响

由图3可以看出，甜瓜叶片SOD与CAT变化趋势一致，与CK相比，HT的SOD和CAT活性分别下降11.28%和45.79%，MTHT提高SOD和CAT活性,分别比CK提高24.51%和25.71%，HT和MTHT差异显著，CK与MTHT处理差异不显著。高温胁迫36 h后处理HT和MTHT均提高了POD活性，但CK与MTHT和HT差异显著。

2.5 外源褪黑素对高温胁迫下甜瓜幼苗抗坏血酸相关酶活性的影响

由图4可以看出，甜瓜叶片DHAR和MDHAR变化规律一致，高温胁迫显著地降低了这2个酶的活性，高温胁迫后，HT分别比CK降低20.27%和47.51%，褪黑素处理后幼苗在高温胁迫下仍维持较高的抗坏血酸循环相关酶活性，DHAR活性较CK没有显著性差异，MDHAR活性较CK提高46.23%，高温胁迫后HT和MTHT的APX活性均呈现上升趋势，且各处理之间差异显著。

图中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同

The different lowercase letters in the same figure indicate significant difference(P<0.05)，the same below

图1 外源褪黑素处理及高温
胁迫下甜瓜幼苗根系活力
Fig.1 Root activity of melon seedlings under exogenous
melatonin and high temperature stress

2.6 外源褪黑素对高温胁迫下甜瓜幼苗抗逆基因表达的影响

为进一步地了解褪黑素响应高温胁迫的分子机制，对3个蛋白保护(HSP70、HSP90和HSP101)基因和抗氧化酶(SOD和APX)基因进行表达量分析，结果如图5所示：HSP70、HSP90、HSP101、SOD、APX基因表达量在高温胁迫后均有不同程度的上调，HSP70、HSP90和HSP101与CK相比分别上调了12.69倍、44.42倍和287.20倍，HT处理后这3个基因分别上调了 2.72倍、14.03倍和63.97倍，HSP70与CK差异不显著。SOD和APX表达分析结果显示，与CK相比HTMT均显著上调表达，HT与CK相比，有轻微的诱导，但与CK差异不显著。

图2 外源褪黑素处理及高温胁迫下甜瓜幼苗MDA质量摩尔浓度和产生速率Fig.2 MDA molality and production rate in leaves of melon seedlings under exogenous melatonin and high temperature stress

图3 外源褪黑素处理及高温胁迫下甜瓜幼苗抗氧化酶活性Fig.3 Antioxidant enzymes activity in melon seedlings under exogenous melatonin and high temperature stress

3 讨论与结论

高温胁迫是最具有破坏性的环境胁迫之一。高温胁迫后，植物生长受到不同程度的影响，表观体现于形态结构变化上[10]。本试验表明，高温胁迫显著的降低了甜瓜幼苗的相对含水量、热害指数和根系活力，而外施褪黑素缓解了高温对甜瓜幼苗造成的伤害。

图4 外源褪黑素处理及高温胁迫下甜瓜幼苗抗坏血酸相关酶活性Fig.4 Ascorba-related enzyme activity in melon seedlings under exogenous melatonin and high temperature stress

图5 外源褪黑素处理及高温胁迫下抗逆基因表达Fig.5 Expression of anti-stress genes under exogenous melatonin and high temperature stress

热休克蛋白作为伴侣分子，是由热胁迫诱导的，以保护细胞蛋白免受不可逆的热诱导损伤[22]。 HSP70和HSP60蛋白是其中最保守的蛋白之一，在热应激反应中起着重要作用[23]。在玉米中，ABA和HSP70的交互作用抵消了热胁迫对蛋白质和酶的影响，保护它们不发生错误折叠和蛋白水解[24]。本试验研究发现外源褪黑素处理后强烈地诱导HSP70、HSP90和HSP101的表达，从而增加HSPs的产生，保护宿主细胞免受热休克引起的损伤。

综上表明，外源褪黑素可以提高甜瓜的耐热性并为甜瓜幼苗在热胁迫下更好地生长提供了一种途径。但要阐明褪黑素与HSP表达之间的关系及其增强翻译还需要进一步研究。