瑞香狼毒化学成分抑制PC-12细胞神经突起生长活性研究

2020-06-04肖淇文田均勉

西北农业学报 2020年5期

肖淇文，田均勉

(西北农林科技大学化学与药学院，陕西杨凌 712100)

瑞香狼毒(StellerachamaejasmeL.)为瑞香科植物，又名断肠草，用药部位为其根，广泛分布于中国西北、西南、东北及河北等地，资源十分丰富[1]。其性味苦平，有逐水祛痰、破积杀虫之功效, 其根已被用于中药作为乳液和皮肤病药物[2]。近年来国内外对其化学成分的研究报道较多，该植物主要含有双黄酮、木脂素、香豆素、二萜等成分，具有抗菌、抗结核、抗肿瘤及抗病毒尤其是抗HIV的活性[3-6]。

神经生长因子(NGF)是第一个被发现且目前研究得最为透彻的神经营养因子，在神经元的生长发育、轴突的生长、递质的合成及细胞的凋亡等阶段起着重要作用，是人和动物体内必不可少的多功能因子[7]。PC-12细胞，也称为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，可以与NGF结合发生神经元样分化,可作为一个细胞模型用于神经生物学和神经化学的研究[8]。NGF在PC-12细胞的膜上有TrkA和p75两类受体，NGF与TrkA受体结合后，激活了细胞内的多条信号通路，诱导PC-12细胞的神经突起生长[9]。同时大量临床前证据表明，阻断NGF与 TrkA的作用可以减轻疼痛和痛觉过敏；动物模型试验已证实，使用抗NGF抗体或非选择性小分子TrkA抑制剂阻断NGF-TrkA信号可抑制疼痛[10-11]。目前尚未有瑞香狼毒中神经突起生长活性研究，为此本研究以湖北恩施瑞香狼毒为试验材料，提取可能具有活性的化合物，以期找到活性优良的药物先导化合物。

1 材料与方法

1.1 试验材料

所用瑞香狼毒于2012年8月采于湖北恩施，并由西北农林科技大学吴振海高级实验师鉴定为瑞香狼毒StellerachamaejasmeL.。标本(20120820SC)保存于西北农林科技大学陕西省天然产物化学生物学重点实验室。Bruker AVANCE-500核磁共振仪(TMS为内标)；ESI-MS采用Thermo Fisher LTQ Fleet；HPLC(QuikSep P0050，慧德易)，GF254薄层层析硅胶板、柱层析硅胶(100～200目、300～400目)及薄层层析硅胶H为青岛康鼎公司生产。反相硅胶PR-C18(YMC公司产品，日本)；凝胶为GE生产；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有机溶剂均为分析纯，天津试剂厂生产。PC-12 细胞(未分化)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。注射用鼠神经生长因子(NGF)购自武汉海特生物制药股份有限公司。

1.2 试验方法

干燥瑞香狼毒根50 kg，粉碎后以95%工业乙醇回流提取，浓缩回收乙醇得总浸膏。对浸膏依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分成石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水相等四个部分。

将乙酸乙酯萃取部位3.2 kg用硅胶(100～200目)拌样进行柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、 4∶6、0∶10；每个梯度50 L)，最后用甲醇(50 L)洗脱，经薄层色谱(TLC)分析，合并相同组分得Eu-1～Eu-10，然后将其中的Eu-8(800 g)继续用硅胶(100～200目)拌样进行柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯(9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、 4∶6、 0∶10)梯度洗脱，经TLC检测，合并相同部分得到Eu-8-1～Eu-8-5。Eu-8-4(418 g)继续经硅胶柱层析分离，共分为7段，另命名为RL1～RL7。将RL4(315.8 g)经中压正相硅胶柱色谱分离得到RL4B1～RL4B18。RL4B2(1.457 g)经正相硅胶和凝胶分离，得到化合物(4)(700 mg)。RL4B5(2.198 g)反相硅胶柱色谱，甲醇-水 (1∶10- 1∶0)分离后得到(6)(79 mg)和化合物(7) (6 mg)。RL4B6(1.260 g)经过正相硅胶和凝胶柱(氯仿-甲醇1∶1)纯化后得到化合物(8)(351 mg)。RL4B7(430 mg)和RL4B8(2.574 g)合并后再次经过硅胶柱层析后得到化合物(5) (7 mg)和化合物(1)(10 mg)。RL4B9(131 mg)由甲醇溶解后，经过半制备HPLC(色谱柱：YMC-Pack ODS-A，250×10 mm，5 μm，12 nm；溶剂：70%甲醇-水，流量：3 mL/min)纯化得到化合物(2)(20 mg, tR=14 min)和化合物(3)(23 mg, tR=21 min)。将Eu-6(70 g)重新用硅胶(100～200目)拌样进行色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯 (9∶1、 8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、 0∶10)梯度洗脱，经TLC检测，合并相同部分得到F1～6，将其中的F6(10.9 g)经过正相硅胶和凝胶(氯仿-甲醇 1∶1)纯化后得到F6C1～3，将F6C2(216 mg)再次使用凝胶柱(甲醇)分离后得到化合物(1)(27.1 mg)。

1.3 NGF介导促神经突起生长活性测定

NGF用PBS(磷酸缓冲液pH 7.2～7.4)溶解，配成NGF原液(20 μg/mL)。待测化合物用DMSO溶解，配成化合物原液(50 mmol/L)。PC-12细胞在F-12完全培养基(10% HS和5% FBS)中生长72 h，之后将PC-12 细胞在24孔板培养24 h待细胞贴壁后，换用新鲜的F-12低血清培养基。NGF原液用PBS稀释至终质量浓度为 20 ng/mL，待测化合物原液用低血清培养基稀释(化合物1～4终浓度为：25 μmol/L)，并分别加入24孔板中。化合物作用72 h后，在倒置显微镜下观察PC-12细胞的形态变化。将含一个或多个神经突起，并且至少有一个神经突起的长度达到胞体直径1倍的细胞视为阳性细胞，选取多个随机视野进行细胞计数，每个随机视野中至少有100个细胞，试验重复3次。细胞分化率计算公式：细胞分化率=有效细胞数/总细胞数。

2 结果与分析

2.1 结构鉴定

化合物(1)为白色无定形粉末，易溶于甲醇溶剂，有紫外吸收。ESI-MS给出分子离子峰为m/z689.2 [M+Na]+，C37H46O11。1H NMR(CD3OD, 500 MHz): δH0.81(m, H, H-8′), 0.93(d, 3H,J=6.3 Hz, H-10′), 0.99(d, 1H,J=4.7 Hz, H-9′), 1.07(m, 1H, H-7′), 1.13(m, 1H, H-5′), 1.15(m, 1H, H-4′), 1.23(d, 1H,J=13.6 Hz, H-6′), 1.47(m, 1H, H-6′), 1.48(m, 1H, H-7′), 1.49(m, 1H, 1.49, H-3′), 1.50(m, 1H, H-5′), 1.61(m, 3H, H-19), 1.69(m, 1H, H-4′), 1.74(s, 4H, H-17,3′), 1.85(m, 1H, H-2′), 2.04(m, 1H, H-2′), 2.16(m, 2H, H-12), 2.21(m, 1H, H-11), 2.31(m, 1H, H-8′), 2.64(dd, 1H,J=9.9, 3.6 Hz, H-1), 2.83(d, 1H,J=3.8 Hz, H-10), 3.24(m, 1H, H-8), 3.40(s, 1H, H-7), 3.68(d, 1H,J=12.6 Hz, H-20), 3.86(d, 1H,J= 12.9 Hz,H-20), 4.37(m, 2H, H-14,18), 4.53(s, 1H, H-5), 4.85(s, 1H, H-16), 4.91(d, 1H,J=12.3 Hz, H-18), 4.99(s, 1H, H-16), 7.51(m, 2H, H-Bz-3′,5′), 7.63(m, 1H, H-Bz-4′), 7.98(d, 2H,J=8.2 Hz, H-Bz-2′,6′) ppm。13C NMR(125 MHz): δC19.3(C-17), 20.1(C-19), 20.2(C-10′), 23.6(C-3′), 25.4(C-4′), 26.2(C-5′), 28.0(C-6′), 28.2(C-7′), 32.6(C-2′), 34.2(C-12), 34.7(C-8′), 36.2(C-8), 39.2(C-9′), 44.3(C-11), 55.9(C-1), 56.2(C-10), 59.3(C-7), 61.6(C-6), 62.5(C-20), 69.5(C-5), 71.4(C-18), 81.9(C-9), 82.3(C-14), 85.2(C-13), 88.6(C-4), 111.8(C-2), 113.2(C-16), 121.5(C-1′), 129.9(Bz-3′,5′), 130.6(Bz-2′,6′), 131.4(Bz-1′), 134.6(Bz-4′), 147.6(C-15), 168.1(Bz-CO), 176.6(C-3) ppm。通过和文献[12]报道的数据比对，确定该化合物为Stelleralide C(图1-1)。

化合物(2)为淡红色粉末，易溶于甲醇溶剂，有紫外吸收。ESI-MS给出分子离子峰为m/z1107 [2M+Na]+，C30H22O10。1H NMR(CD3OD, 500 MHz): δH4.61(d, 1H,J= 12.0 Hz, H-11), 5.72(s, 2H, H-16, 18), 6.10(d, 1H,J=1.9 Hz, H-6), 6.20(d, 1H,J=1.9 Hz, H-8), 6.33(d, 1H,J=12.0 Hz, H-12), 6.54(d, 2H,J=8.5 Hz, H-22, 24), 6.60(d, 2H,J=8.5 Hz, H-28, 30), 7.02(d, 2H,J=8.5 Hz, H-21, 25), 7.16(d, 2H,J=8.5 Hz, H-27, 31), 7.96(s, 1H, H-2)。13C NMR(125 MHz): δC49.7(C-11), 54.9(C-12), 94.7(C-8), 96.1(C-16, 18), 100.0(C-6), 105.8(C-10), 106.6(C-14), 115.9(C-28, 30), 116.0(C-22, 24), 122.4(C-3), 130.1(C-21, 25), 131.1(C-27, 31), 135.4(C-26), 136.2(C-20), 156.6(C-23, 29), 156.7(C-2), 159.3(C-9), 163.5(C-5), 165.5(C-17), 165.7(C-15, 19), 166.4(C-7), 181.7(C-4), 204.9(C-13)。其核磁数据与文献[13]报道的狼毒色原酮(Chamaechromone)的核磁数据基本一致，故确定该化合物为狼毒色原酮(图1-2)。

化合物(3)为黄色粉末，易溶于甲醇溶剂，有紫外吸收。ESI-MS给出分子离子峰为m/z1107 [2M+Na]+，C30H22O10。1H NMR(CD3OD, 500 MHz):δH3.14(m, 1H, H-3), 3.27(dd, 1H,J=8.8, 3.5 Hz, H-3′), 5.14(d, 1H,J=8.8 Hz, H-2″), 5.55(d, 1H,J=4.7 Hz, H-2), 5.76(d, 1H,J=2.2 Hz, H-6), 5.78(d, 1H,J=2.2 Hz, H-6″), 5.87(d, 1H,J=2.2 Hz, H-8), 5.98(d, 1H,J=2.2 Hz, H-8″), 6.65(d, 2H,J=8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.79(d, 2H,J=8.5 Hz, H-3″′, 5″′), 6.93(d, 2H,J=8.5 Hz, H-2′, 6′), 7.15(d, 2H,J=8.5 Hz, H-2″′, 6″′)。13C NMR(CD3OD, 125 MHz):δC50.0(C-3), 50.9(C-3″), 81.6(C-2), 83.4(C-2″), 96.2(C-8), 96.5(C-8″), 97.2(C-6), 97.4(C-6″), 103.9(C-10), 105.2(C-10″), 116.3(C-3′, 5′), 116.5(C-3″′, 5″′), 128.6(C-2′, 6′), 128.9(C-1′), 129.2(C-1″′), 130.4(C-2″′, 6″′), 158.7(C-4′), 159.1(C-4″′), 163.5(C-9), 165.3(C-5, 9″), 165.6(C-5″), 168.4(C-7), 168.6(C-7″), 196.4(C-4), 198.7(C-4″)。通过和文献[14]报道的数据比对，确定该化合物为新狼毒素B(Neochamaejasmin B)(图1-3)。

化合物(4)为黄色粉末，易溶于甲醇溶剂，有紫外吸收。ESI-MS 给出分子离子峰为m/z565 [M+Na]+，C30H22O10。1H NMR(CD3OD, 500 MHz):δH3.76(m, 2H, H-3, 3″), 4.79(m, 2H, H-2, 2″), 5.75(s, 2H, H-6, 6″), 5.89(s, 2H, H-8, 8″), 6.80(d, 4H,J=8.5 Hz, H-3′, 5′, 3″′, 5″′), 7.02(d, 4H,J=8.5 Hz, H-2′, 6′, 2″′, 6″′)。13C NMR(CD3OD, 125 MHz): δC51.4(C-3, 3″), 82.6(C-2, 2″), 96.3(C-8, 8″), 97.5(C-6, 6″), 102.9(C-10, 10″), 116.7(C-3′, 5′, 3″′, 5″′), 129.1(C-1, 1″′), 130.9(C-2′, 6′, 2″′, 6″′), 159.9(C-4′, 4″′), 164.5(C-9, 9″), 165.6(C-5, 5″), 168.5(C-7, 7″), 197.0(C-4, 4″)。通过和文献[15]报道的数据对比，最终确定该化合物为异新狼毒素A(Isoneochamaejasmin A)(图1-4)。

化合物(5)为白色固体，易溶于氯仿溶剂，难溶于石油醚等低极性有机溶剂，有紫外吸收。ESI-MS中出现m/z275 [M+H]+，C15H14O5。1H-NMR(CDCl3, 500 MHz) :δH2.57(1H, dd,J=16.2, 8.2 Hz, H-4), 2.92(1H, dd,J=16.2, 5.5 Hz, H-4), 4.03(1H, m, , H-3), 4.64(1H, d,J=7.9 Hz, H-2), 5.95(1H, d,J=2.2 Hz, H-6), 6.01(1H, d,J=2.2 Hz, H-8), 6.81(1H, d,J=8.5 Hz, H-3′, 5′), 7.23(1H, d,J=8.5 Hz, H-2′, 6′)。13C-NMR(CDCl3, 125 MHz):δC28.6(C-4), 68.7(C-3), 82.6(C-2), 95.7(C-6), 96.5(C-8), 101.1(C-10), 116.1(C-3′, 5′), 129.6(C-2′, 6′), 131.3(C-1′), 156.8(C-9), 157.3(C-5), 157.5(C-7), 158(C-4′)。其光谱数据与文献[16]中枇杷素的光谱数据对照基本一致，故鉴定为枇杷素(Afzelechin)(图1-5)经过查阅文献发现为首次从该植物中分到。

化合物(6)为黄色针晶，能够溶于甲醇，有紫外吸收。ESI-MS给出分子离子峰为m/z287 [M+H]+，C15H10O6。1H NMR(CD3OD, 500 MHz): δH6.19(m, 1H, H-6), 6.40(m, 1H, H-8), 6.91(d, 2H,J=6.0 Hz, H-3′, 5′), 8.08(d, 2H,J=6.0 Hz, H-2′, 6′)。13C NMR(CD3OD, 125 MHz): δC94.7(C-8), 99.5(C-6), 104.7(C-10), 116.5(C-3′, 5′), 123.9(C-1′), 130.8(C-2′, 6′), 137.3(C-3), 148.3(C-2), 158.4(C-5), 160.6(C-4′), 162.6(C-9), 165.7(C-7), 177.6(C-4)以上数据和文献[17]一致，鉴定该化合物为山萘酚(kaempferol) (图1-6)。

化合物(7)为白色结晶，能够溶于甲醇、氯仿-甲醇混合溶剂，有紫外吸收。ESI-MS中出现了m/z743 [2M+Na]+，C20H24O6。1H NMR(CD3OD, 500 MHz): δH1.77(m, 1H, H-8′), 2.00(m, 1H, H-8), 2.77(d, 2H,J=7.6 Hz, H-7), 3.40(dd, 1H,J=11.3, 4.1Hz, H-9′), 3.66(m, 1H, H-9), 3.67(m, 1H, H-9), 3.70(dd, 1H,J=11.3, 4.1 Hz, H-9′) 3.76(s, 3H, 3-OMe), 3.78(s, 3H, 3′-OMe), 3.80(s, 1H, H-7′), 6.20(s, 1H, H-5), 6.61(dd, 1H,J=8.2, 1.3 Hz, H-6′), 6.64(s, 1H, H-2), 6.68(d, 1H,J=1.6 Hz, H-2′), 6.74(d, 1H,J=7.9 Hz, H-5)。13C NMR(CD3OD,125 MHz): δC33.7(C-7), 40.2(C-8), 48.1(C-7′), 48.2(C-8′), 56.5(3-OMe), 56.6(3′-OMe), 62.5(C-9′), 66.1(C-9), 112.6(C-2), 114.0(C-2′), 116.2(C-5′), 117.5(C-5), 123.3(C-6′), 129.2(C-1), 134.3(C-6), 138.7(C-1′), 145.3(C-4), 146.0(C-4′), 147.3(C-3), 149.1(C-3′)。通过对比文献[18]数据，发现该化合物的核磁数据和异落叶松脂醇完全相同，因此该化合物结构被确定为异落叶松脂醇(Isolariciresinol)(图1-7)经过查阅文献发现为首次从该植物中分到。

图1 化合物1～9的化学结构Fig.1 Chemical structure of compounds 1-9

化合物(8)为白色晶体，能够溶于甲醇、氯仿-甲醇混合溶剂，有紫外吸收。ESI-MS中出现了m/z743 [2M+Na]+，C20H24O6。1H NMR(CD3OD, 500 MHz): δH2.38(m, 1H, H-8), 2.50(dd, 1H,J=13.5, 11.5 Hz, H-7′), 2.73(m, 1H, H-8′), 2.93(dd, 1H,J=13.5, 4.7 Hz, H-7′), 3.64(dd, 1H,J=11.0, 6.3 Hz, H-9), 3.72(dd, 1H,J=8.4, 6.1 Hz, H-9′), 3.83(dd, 1H,J=11.0, 6.3 Hz, H-9), 3.83(s, 3H, 3-OMe), 3.84(s, 3H, 3′-OMe), 3.98(dd, 1H,J=8.4, 6.8 Hz, H-9′), 4.75(d, 1H,J=6.9 Hz, H-7), 6.64(dd, 1H, H-6′), 6.72(d, 1H, H-5′), 6.77(s, 2H, H-5, 6), 6.80(d, 1H,J=1.3 Hz, H-2′), 6.91(s, 1H, H-2)。13C NMR(CD3OD, 125 MHz): δC33.8(C-7′), 44.0(C-8′), 54.2(C-8), 56.6(3,3′-OMe), 60.7(C-9), 73.7(C-9′), 84.3(C-7), 111.0(C-2), 113.7(C-2′), 116.2(C-5), 116.4(C-5′), 120.0(C-6), 122.4(C-6′), 133.7(C-1′), 136.0(C-1), 146.0(C-4), 147.2(C-3), 149.2(C-3′,4′) ppm, 与文献[19]对照，确定该化合物为(-)-落叶松树脂醇((-)-lariciresinol)(图1-8)经过查阅文献发现该化合物为首次从该植物中分到。

化合物(9)为无色结晶，能够溶于甲醇、氯仿-甲醇混合溶剂，有紫外吸收。ESI-MS中出现了m/z441 [M+Na]+，C22H26O8。1H NMR(CD3OD, 500 MHz): δH3.04(m, 2H, H-8, 8′), 3.76(s, 12H, 3,3′, 5, 5′-OMe), 3.85(dd, 2H,J=9.0, 2.5 Hz, H-9, 9′), 4.22(dd, 2H,J=9.0, 6.8 Hz, H-9, 9′), 4.67(d, 2H,J= 3.8 Hz, H-7, 7′), 6.53(s, 4H, H-2, 2′, 6, 6′)。13C NMR(CD3OD, 125 MHz): δC53.8(C-8, 8′), 55.8(-OMe×4), 71.3(C-9, 9′), 85.5(C-7, 7′), 102.4(C-2, 2′, 6, 6′), 131.5(C-1, 1′), 133.9(C-4, 4′), 146.8(C-3, 3′, 5, 5′)，通过与文献[20]核磁数据进行对照，该化合物的结构被确定为消旋丁香脂素((-)-syringaresinol)(图1-9)。

2.2 NGF诱导神经突起生长活性测定结果

测定化合物1～4的NGF诱导神经突起生长活性测定结果(图2，图3)，与空白对照0.1%DMSO(2.5%)和 20 ng/mL的NGF 对照 (16.29%)相比，化合物1～4(25 mmol/L)与 NGF(20 ng/mL)共同作用于PC-12细胞72 h后，其细胞分化率降低，分别为10.87%(化合物2)、 7.67%(化合物3)、10.47%(化合物4)。经PC-12的MTT细胞毒活性试验发现，化合物 1～9均没有细胞毒活性，且化合物2～4促进了细胞活力。所以化合物2～4(25 μmol/L)表现为明显的抑制NGF依赖的神经突起生长活性(P<0.05)。而化合物1(25 μmol/L)对 PC-12 细胞表现出强烈的NGF介导的细胞毒活性。

DMSO(0.1%)为阴性对照，NGF(20 ng/mL)为阳性对照

3 结论

本研究从瑞香狼毒乙酸乙酯提取物中分离得到9个化合物，分别鉴定为Stelleralide C(1)，狼毒色原酮(2)，新狼毒素B(3)，异新狼毒素A(4)，枇杷素(5)，山萘酚(6)，异落叶松树脂醇(7)，(-)-落叶松树脂醇(8)，消旋丁香脂素(9)。化合物5、7和8为首次从该植物中分离得到。NGF诱导神经突起生长活性测定表明化合物2～4 具有抑制NGF介导的神经突起生长活性，化合物1对PC-12 细胞表现出显著的NGF介导的细胞毒活性。

阴性对照为0.1 %的DMSO，阳性对照为20 ng/mL的 NGF。与NGF对照相比，*表示差异显著，P<0.05(单因素方差分析ANOVA)

DMSO(0.1 %DMSO) served as a negative control, NGF (20 ng/mL) served as a positive control. *P<0.05 represent significant differences compared with NGF control (ANOVA)

图3 化合物2～4(25 μmol/L)与 NGF共同作用于PC-12
细胞后对其神经突起生长的影响
Fig.3 Effects of compound 2～4(25 μmol/L) on neurite
out growth in NGF-induced PC-12 cells