牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2、 pVAX1-HA2/IL-15鼻腔黏膜免疫SD大鼠的实验研究

白国辉 曾凤娇 杨琳 陈靖 刘建国 田源

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)，一种革兰氏阴性厌氧球菌，与慢性牙周炎的发生密切相关。P.gingivalis通过其细胞表面的HA2基因与血红蛋白中血红素的卟啉环结合去获得其生存所必需的铁和卟啉, 同时P.gingivalis生存的厌氧环境也需要菌体表面的血红素维持[1]。张荃等[2]认为HA2基因是P.gingivalis引起牙周炎的相关因子之一，在DNA和RNA水平上证实了HA2基因与牙周状态有着紧密联系。白细胞介素-15(interleukin-15，IL-15)，通过诱导B1细胞的增殖分化，使其分化出分泌SIgA的浆细胞，达到抵御细菌对黏膜粘附从而防御病原入侵的作用。本课题组前期以HA2基因作为目的基因，IL-15作为免疫佐剂成功制备了牙周炎基因疫苗 pVAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15。并通过RT-PCR在脂质体转染的真核细胞293T中证实，目的基因HA2在mRNA水平能够被正确表达。以及制备了相应的蛋白抗原，应用PCR、Western Blot、ELISA等技术证实目的基因在体外能够被正确表达。本次实验在前期基础上，通过牙周炎基因疫苗经鼻腔黏膜免疫SD大鼠后，检测唾液中相关的特异性抗体水平变化，观察该基因疫苗的免疫原性，探索牙周炎基因疫苗防治牙周病的可行性。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

SD大鼠(第三军医大学野战外科研究所动物室，质检单位：重庆市实验动物质检中心，许可证号：SCXK (渝)2012-0005)。牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15、 空载体pVAX1、 HA2抗原为课题组前期构建和保存； Goat anti-Mouse IgA Cross-Adsorbed( Thermo,美国)； 牛血清白蛋白(BSA)、 Secondary Antibody、 HRP(Amresco公司，美国)。戊巴比妥钠(上海哈灵生物科技有限公司)； 2%硝酸毛果芸香碱(山东正大福瑞达制药有限公司)。

1.2 主要试剂配制

Elisa相关试剂配置详见参考文献[3]。

1.3 实验动物分组与免疫

32只7周龄雌性SD大鼠随机分为4 组，每组8 只。实验组：A、B组，对照组：C、D组。具体如下：A组：pVAX1-HA2组；B组：pVAX1-HA2/IL-15组；C组：pVAX1组；D组：生理盐水组。免疫3 次，在第0 天、 7 天、 14 天对大鼠进行双侧鼻腔黏膜免疫，免疫剂量为200 μg/次/(1 μg/1 μl)。

1.4 样本采集

采集实验动物唾液样本，免疫前1天及免疫后每周，连续收集9 周。采集方式为腹腔注射2%硝酸毛果芸香碱(0.3 ml/100 g)，约1 min后收集唾液量约0.5 ml。 4 ℃，12 000 r/min离心15 min，取上清，-80 ℃保存备用。

1.5 间接ELISA法检测唾液中sIgA抗体水平

以交叉连续稀释分析法确定出酶标抗体过氧化酶标记羊抗大鼠IgA最佳工作浓度为: 1∶4 000, HA2、FimA抗原最佳包被浓度为2.5 μg/ml；唾液样本最佳稀释浓度1∶4。按浓度梯度包被96 孔酶标板，5% BSA封闭，每孔加入100 μl唾液样本(PBST 1∶4稀释)。 37 ℃湿盒温育2 h，加入HRP标记的羊抗大鼠IgA抗体(1∶4 000),底物显色，酶标仪检测A450值。

1.6 免疫部位目的蛋白的表达的检测

免疫后第5 周每小组取2 只大鼠处死，分离鼻腔黏膜，固定、包埋、 5 μm 连续切片,免疫组织化学检测。先进行抗原修复(HA2：0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液加热10 min 30 s)所用抗体如下：一抗为根据预实验确定HA2：1∶200; 阴性对照以PBS代替一抗，4 ℃过夜；二抗37 ℃孵育20 min。DAB显色，常规透明、脱水和封片。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 唾液中特异性抗体检测

免疫后第1 周抗体水平开始上升，2～5 周逐步上升，于第5 周达到高峰，第9 周抗体基本降低到免疫前水平。牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15经鼻黏膜免疫产生的唾液SIgA型抗体水平明显高于空载组和生理盐水组。pVAX1-HA2/IL-15组诱导抗体水平除第2 周外均高于pVAX1-HA2组； pVAX1-HA2组于第8 周抗体水平已趋近于免疫前水平，而pVAX1-HA2/IL-15组在第9 周表现出此现象，说明IL-15佐剂的使用可能有助于维持抗体高水平的持续时间(图 1，表 1)。

图 1 大鼠唾液中SIgA型抗HA2 抗体水平趋势图

表 1 各组SD大鼠唾液中SIgA型抗HA2抗体A450值组间比较(P值)

2.2 鼻腔黏膜目的蛋白的表达的观察

HA2蛋白在鼻腔黏膜固有层中黏液性腺泡，腺体及部分巨噬细胞胞质内见棕黄色目的蛋白的表达，对照组没有出现阳性染色(图 2)。

A：pVAX1-HA2滴注组; B：pVAX1-HA2/IL-15滴注组; C：pVAX1空载体滴注组

图 2 HA2蛋白免疫组化定位(×400)

A: pVAX1-HA2 group; B: pVAX1-HA2/IL-15 group; C: pVAX1 blank control group

Fig 2 Immunohistochemical localization of HA2 protein(×400)

2.3 一般安全性检查

2.3.1 实验中SD大鼠的体重整体变化呈逐渐上升趋势，比较相同时间各组中SD大鼠的体重发现差异不具有统计学意义(P>0.05)(图 3，表 2)。

2.3.2 病理切片检查 由(图 4～8)可看出各实验组及对照组SD大鼠的脏器均未见明显异常病理学变化。

3 讨 论

P.gingivalis的生长和定植都要依靠铁及卟啉，但其自身缺乏合成卟啉及铁的能力，而血红素可以为P.gingivalis提供其生存所需的铁和卟啉[4-7],因此结合和吸收血红素成为P.gingivalis保持活性的条件。而P.gingivalis在降解血红蛋白、摄取血红素过程中发挥主要作用的结构是血凝集素/黏附结构域[8-10]。在血凝素基因hagA的核心区域的四段序列中，HA2发挥着重要作用，它与血红蛋白绑定, 溶解红细胞获得血红蛋白的赖氨酸、吸收铁、血红素或卟啉[11]，是使P.gingivalis聚集的多功能蛋白区。这提示我们可以通过研制以HA2基因作为目的基因的疫苗去抑制P.g的生长和定植从而预防P.gingivalis诱导的牙周炎。

A：pVAX1-HA2滴注组; B：pVAX1-HA2/IL-15滴注组; C：pVAX1空载体滴注组D：生理盐水滴注组

图 3 随时间变化各实验组大鼠体重结果

A: pVAX1-HA2 group; B: pVAX1-HA2/IL-15 group; C: pVAX1 blank control group; D: Normal saline control group

Fig 3 The weight levels of SD rats

图 4 SD大鼠主要脏器病理切片检查(HE，×200)

Fig 4 Tissue pathological test of main organs of SD rats(HE, ×200)

有效的免疫原对疫苗的效果起主要影响，但选择合适的免疫途径也可以有利于提高疫苗的作用。在以往的研究中，Kuboniwa等[12]曾使用pcDNA3-fimA DNA疫苗经唾液腺内注射的途径免疫小鼠，张凤秋等[13]使用经颌下腺注射的途径免疫小鼠。目前，在牙周炎基因疫苗的相关研究中用到的免疫途径主要有：口服疫苗免疫，黏膜免疫、腺体免疫、肌肉注射、经颌下腺靶向注射疫苗等[14]。与黏膜免疫相比较，口服疫苗使得疫苗暴露于消化道中，容易降解破坏，导致不能产生理想的免疫反应，经颌下腺靶向注射疫苗途径又不容易被人们接受。而鼻腔黏膜免疫作为一种黏膜免疫途径,相较于其它免疫途径，在利用更少量的免疫原的情况下便可以更早更广泛地诱导产生体液免疫应答和黏膜共同免疫应答，增强了免疫效果。因此本实验选择经鼻黏膜免疫SD大鼠的免疫途径是可行的。

本实验使用课题组前期构建的牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2、 pVAX1-HA2/IL-15对SD大鼠进行鼻黏膜免疫，诱导其产生SIgA抗体。结果显示：经检测，无论是pVAX1-HA2组还是pVAX1-HA2/IL-15组疫苗经鼻黏膜免疫后可诱导机体产生特异性SIgA抗体，抗体水平与对照组及免疫前相比均升高，说明本课题组构建的牙周炎疫苗pVAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15具有一定的免疫原性且经一般安全检测初步证实该疫苗无毒性。本实验为牙周炎基因疫苗的候选基因的选择上提供了新的方向，为进一步研究奠定了基础。