碱性蛋白酶酶解提取羊血血红素工艺条件优化

祝 霞，李 颍，付文力，杜 娜，习 京，韩舜愈，盛文军，牛黎莉，杨学山，*

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州730070）

碱性蛋白酶酶解提取羊血血红素工艺条件优化

祝 霞1，李 颍1，付文力2，杜 娜1，习 京2，韩舜愈1，盛文军1，牛黎莉1，杨学山2，*

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州730070）

以羊血为试材，血红素得率为指标，在加酶量、酶解pH、酶解温度和酶解时间等单因素实验基础上，采用正交实验优化工艺参数。结果表明最佳反应参数为碱性蛋白酶加酶量8000U/g血红蛋白、酶解pH8.5、酶解温度55℃、酶解时间4h，在此条件血红素得率达到85.3%，即1L羊血可提取3.93g血红素。该法所得产品的安全性高，适合工业化生产。

碱性蛋白酶，羊血，血红素，工艺条件

血红素又名高铁血红素、正铁血红素、羟基血红素，主要存在于动物血液和肌肉组织中，具有重要的生理功能和使用价值[1]。在食品工业中，血红素作为天然色素，可替代熟肉制品中危及人体健康的发色剂亚硝酸盐及人工合成色素[2]；在医药行业中，血红素可用作易被人体直接吸收补铁剂，治疗缺铁性贫血[3]；此外血红素还可用于制备抗癌药物的卟啉前体[4]。

甘肃省是全国五大牧区之一，拥有丰富的牛羊血液资源，是开发血红素的宝贵资源。但实际生产中利用率极低，甚至造成严重的环境污染，因此急需开展血红素制备技术研究。以动物血液为原料制备血红素的关键环节是血红蛋白的水解，目前国内外常采用冰醋酸法[5]、酸性丙酮法[6]、醋酸钠法[7]、蒸馏法[8]、鞣酸法[9]、羧甲基纤维素（CMC）[10]等法水解制备血红素，存在产品纯度低、生产周期长和溶剂回收困难等问题。生物酶解猪血、牛血血红蛋白制备血红素不仅可以避免酸、碱水解血红蛋白时生产周期长、腐蚀设备、污染环境等缺陷，而且极大的提高了产品的安全性[11-13]，但生物酶解羊血制备血红素尚未见报道。本实验以不同蛋白酶水解羊血红蛋白效果比较为基础，利用碱性蛋白酶水解羊血血红蛋白，并采用正交实验优化提取工艺，以期为羊血资源开发利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜羊血 购自甘肃兰州小西湖屠宰场；血红素标准品（纯度98%）、碱性蛋白酶（20万U/g）、中性蛋白酶（5万U/g）、胰蛋白酶（100万U/g） Sigma公司；氢氧化钠、盐酸、氯化钠、柠檬酸钠等 均为国产分析纯。

SL-1001电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；TDZ5-WS离心机 湘仪离心机仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；PHS-3C pH计 上海雷磁有限公司；808型紫外-可见分光光度计 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水解酶选择 分别按8000U/g（E/S）添加中性蛋白酶（pH 7.0、50℃）、碱性蛋白酶（pH 9.0、50℃）、胰蛋白酶（pH8.0、37℃），在各酶最适作用条件下水解等量溶血液10h，间隔1h取样，加入等体积5%三氯乙酸，离心，取上清液测定A280。

1.2.2 碱性蛋白酶水解制备羊血血红素技术路线 新鲜羊血→预处理→分离红血球→溶血→酶解→离心去除沉淀→调节pH→离心→收集沉淀→离心→血红素样品→提取率计算。

1.2.3 操作要点 参照文献[11-13]方法，并改进。

1.2.3.1 羊血预处理 将收集的新鲜羊血去除毛等杂质，加入10.0g/L柠檬酸三钠抗凝。

1.2.3.2 分离红血球 取新鲜抗凝羊血，以5000r/m in离心15min，收集红血球沉淀；将红血球加0.9g/100m L NaCl溶液，5000r/m in离心10m in，重复3次，得洁净红血球。

1.2.3.3 溶血 取洁净红血球100m L，加等量去离子水搅拌溶血。取样测定血红蛋白含量。

1.2.3.4 酶解 取溶血液50m L，调节pH 8.5，加入碱性蛋白酶（8000U/g血红蛋白），放入恒温水浴振荡器（120r/m in），50℃酶解6h。冷却后4000r/m in离心15m in，收集上清液。

1.2.3.5 调节pH 浓盐酸调节上清液pH 4.5，4000r/m in离心15m in，将沉淀用蒸馏水溶解，烘干得血红素样品。称重并测定A385，计算血红素得率。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 加酶量对血红素得率的影响 取羊血溶血液各50m L，分别加入6000、7000、8000、9000、10000U/g血红蛋白的碱性蛋白酶，调节pH 8.5，50℃恒温水浴酶解6h，离心收集上清液，浓盐酸调节上清液pH 4.5，离心，沉淀用蒸馏水溶解，烘干得血红素样品。

1.2.4.2 酶解pH对血红素得率的影响 取羊血溶血液各50m L，加入8000U/g血红蛋白的碱性蛋白酶，调节pH分别为7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，50℃恒温水浴酶解6h，离心收集上清液，浓盐酸调节上清液pH 4.5，离心，沉淀用蒸馏水溶解，烘干得血红素样品。

1.2.4.3 酶解温度对血红素得率的影响 取羊血溶血液各50m L，加入8000U/g血红蛋白的碱性蛋白酶，调节pH 8.5，分别放入40、45、50、55、60℃恒温水浴振荡酶解6h，离心收集上清液，浓盐酸调节上清液pH4.5，离心，沉淀用蒸馏水溶解，烘干得血红素样品。

1.2.4.4 酶解时间对血红素得率的影响 取羊血溶血液各50m L，加入8000U/g血红蛋白的碱性蛋白酶，调节pH8.5，放入恒温水浴振荡器，50℃分别酶解2、4、6、8、10h，离心收集上清液，浓盐酸调节上清液pH 4.5，离心，沉淀用蒸馏水溶解，烘干得血红素样品。

1.2.5 正交实验优化 根据单因素实验结果确定正交实验因素和水平，采用L9（34）正交实验设计，优化碱性蛋白酶酶解提取羊血血红素最优工艺，平行重复3次。正交实验因素水平见表1。

表1 L9（34）正交实验因素水平表Table 1 Factors and their levels in L9（34）orthogonal array design

1.2.6 血红蛋白定量测定 采用考马斯亮蓝法[14]。

1.2.7 血红素定量测定 参照文献[15]方法进行：以0.1mol/L NaOH溶解血红素标准品，调整至适宜浓度，测定A385，建立标准曲线。称取干燥至恒重的血红素提取样品20mg，定溶于50m L 0.1mol/L NaOH溶液，测定A385，代入回归方程即可求得血红素浓度。根据公式（1）、（2）、（3）计算血红素含量、纯度及收率。

血红素含量（g）=血红素浓度（μg/m L）×50m L×10-6式（1）

纯度（%）=血红素含量（g）/血红素样品质量（g）× 100 式（2）

血红素得率（%）=血红素样品质量×血红素样品纯度/总血量中含血红素理论值×100 式（3）

注：血红蛋白相对分子质量（64500）、血红素相对分子质量（651.96）、血红蛋白含量（128.48g/L），可得羊血中血红素理论值为4.61g/L。

1.2.8 数据处理 本实验数据采用SPSS 13.0软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 水解酶选择

三氯乙酸可沉淀四肽以上的片段，其可溶性氮的多少直接反映蛋白酶的水解能力，因此测定酶解上清液的肽含量（A280）可显示水解度大小[16]。三种不同蛋白酶酶解羊血血红蛋白结果见图1。

图1 各种蛋白酶水解曲线Fig.1 Hydrolysis curves of differentenzymes

由图1可知，在底物浓度、酶总活力相同，且在各酶最适温度、pH下进行反应，随着时间的延长，血红蛋白的水解程度均不同程度增大，其中碱性蛋白酶水解能力最强。因此，实验选择碱性蛋白酶水解羊血溶血液制备血红素。

2.2 血红素标准曲线

血红素标准曲线见图2。由图2可知，在2.0～ 12.0μg/m L范围内血红素的浓度与吸光度呈线性关系。标准曲线回归方程为：y=0.0678x-0.0179，相关系数R2=0.9995。

图2 血红素标准曲线Fig.2 Standard curve of hemin

2.3 单因素实验

2.3.1 加酶量对血红素得率的影响 由图3可知，加酶量对水解反应有一定的影响，酶量越大，与底物作用的酶分子就越多，当酶分子将底物饱和之后，再增加酶量对酶解反应无促进作用。酶量增加，血红素提取率呈现上升趋势。在加酶量8000U/g血红蛋白时，血红素提取率达到最大值，此后几乎不再增加。说明底物已经基本被酶饱和，增加酶量对反应贡献不大。因此实验选择加酶量为8000U/g血红蛋白。

图3 加酶量对血红素得率的影响Fig.3 Effectof enzyme concentration on heme yield

2.3.2 酶解pH对血红素得率的影响 酶作为一种特殊的蛋白质分子，其酶促催化反应的能力与环境pH密切相关。环境pH会影响酶分子的构象和酶分子及底物的解离状态，从而影响酶的活性和酶促反应速度，pH过高、过低均对酶促反应不利。由图4可知，当pH 8.5时血红素得率达到最大值，为较佳酶解pH；pH低于或高于8.5，血红素得率均呈下降趋势。因为非最适pH抑制了酶活性，影响了酶解效率。

2.3.3 酶解温度对血红素得率的影响 由图5可知，酶解温度对血红素得率有较大影响。血红素得率在50℃左右时达到最大值；随着温度的继续升高，血红素得率呈下降趋势。同时在55℃以上，羊血有凝固的趋势，不利于进行后续实验操作。因此，实验酶解温度选择50℃为较佳酶解温度。

图4 酶解pH对血红素得率的影响Fig.4 Effectof enzyme pH on heme yield

图5 酶解温度对血红素得率的影响Fig.5 Effectof enzymatic hydrolysis temperature on heme yield

2.3.4 酶解时间对血红素得率的影响 由图6可知，酶解反应在4h后血红素得率趋于缓慢下降。水解时间延长没有进一步提高血红素得率，说明反应已经基本达到平衡且随时间延长，水解液发生了变质。考虑到生产过程中溶剂损失、电能消耗、生产周期、经济效益及防止水解液变质等因素，实验选择酶解时间为4h。

图6 酶解时间对血红素得率的影响Fig.6 Effectof enzyme digestion time on heme yield

2.4 正交实验

根据单因素实验结果，以血红蛋白酶解后血红素得率为指标，选取对血红素得率有较大影响的加酶量（A）、酶解pH（B）、酶解温度（C）和酶解时间（D）进行L9（34）正交实验，结果见表2。通过实验结果统计分析，得到最优组合并进行验证实验，确定碱性蛋白酶酶解提取羊血血红素的最优工艺条件。

由表2可知：各因素对血红素得率的影响大小依次为A＞B＞D＞C，最佳工艺条件组合为A2B2C3D2，即加酶量8000U/g血红蛋白、酶解pH8.5、酶解温度55℃、酶解时间4h。

表2 碱性蛋白酶水解提取羊血血红素正交实验结果Table 2 Results of orthogonal testalkaline protease hydrolysis sheep haemoglobin

用SPSS 13.0统计软件对实验结果进行方差分析，其结果见表3。

表3 正交实验方差分析结果Table 3 Analysis of variances for extraction yield ofpolysaccharideswith various extraction

由表3可知，因素A显著性p＜0.05，差异显著；因素B、C、D不显著，表明碱性蛋白酶加酶量对本实验影响较大。

2.5 验证实验

由于最优组合在L9（34）正交实验设计中未出现，需对正交实验得到的最优组合进行验证实验。在加酶量8000U/g血红蛋白、酶解pH 8.5、酶解温度55℃、酶解4h条件下分离提取血红素，重复3次。血红素平均得率为85.3%，比正交实验中其他组合得率都高，可见其为正交实验确定的最佳工艺参数。

3 结论

本实验采用碱性蛋白酶从羊血中提取血红素，在单因素实验的基础上，通过正交实验，确定最佳工艺条件为加酶量8000U/g血红蛋白、酶解pH8.5、酶解温度55℃、酶解时间4h，在此条件下，血红素得率达到85.3%，即1L羊血可提取3.93g血红素，纯度达到87.9%。该法绿色环保，所得产品的安全性高，具有较好的经济效益和社会效益，市场前景较为乐观。

[1]王君，康平利.超声波法提取氯化血红素的研究[J].药物生物技术，2004，11（4）：260-263.

[2]MAN JIN，HEE JEONG CHAE，OH NAM-SOON.Process development for heme-enrichedpeptide by enzymatic hydrolysis of hemoglobin[J].Bioresource Technology，2002，84（1）：63-68.

[3]HUANGWEN，XUEAN，NIUHAI，etal.Optimised ultrasonicassisted extraction of flavonoids from Folium eucommiae and evaluation of antioxidant activity inmulti-test systems in vitro[J]. Food Chemistry，2009，114（3）：1147-1154.

[4]NAMA N A，VRONIQUE D D，ADJE E Y，et al.Bovine hemoglobin：An attractive source of antibacterial peptides[J]. Peptides，2008，29（6）：969-977.

[5]钟耀广.利用冰醋酸提取血红素的研究[J].食品科学，2004，25（4）：90-95.

[6]汪长国，戴亚，刘少民，等.超声波酸性丙酮法制备氯化血红素[J].食品科学，2010，31（6）：109-112.

[7]李敏康，钱冬明，李红心.提取氯化血红素新工艺的研究[J].食品科技，2005（12）：51-53.

[8]晨光，庄红，吕学举，等.动物血液血红素铁提取方法研究[J].食品工业科技，2008（1）：308-310.

[9]CHAE H J，IN M J，KIM D H，et al.Rapid determination of degree of hydrolysis for hemoglobin by osmometry[J].Korean SOC Agric Chem Biotechnol，2001，44（3）：143-147.

[10]李志钊，叶春华.血红素制备方法及应用与生产技术研究进展[J].食品研究与开发，2010，31（5）：12-14.

[11]吴保承，沈国强，杨春霞，等.酶法提取猪血中血红素的工艺研究[J].化学与生物工程，2009，26（8）：61-63.

[12]管刚，张俊，赵静，等.应用碱性蛋白酶制取牦牛血红素工艺的研究[J].食品科技，2009，34（10）：133-136.

[13]杨万根，王卫东，孙会刚，等.复合酶水解猪血红蛋白制备富血红素多肽[J].食品科学，2011，32（6）：7-10.

[14]翟桂香，董明盛，黄耀江，等.不同蛋白酶水解猪血红蛋白制备血红素的对比研究[J].江西农业学报，2007，19（7）：92-93.

[15]YU YING，GUWEIXIN，LIANG JIAPIN，et al.Optimization ofextraction processofheme from sheep blood by response surface methodology[J].Food Chemistry，2009，107（8）：1639-1646.

[16]张华山.猪血蛋白的酶水解及氨基酸含量[J].氨基酸和生物资源，2006，27（3）：54-56.

Process optim ization of the alkaline enzymatic extracting heme from sheep blood

ZHU Xia1，LIYing1，FUW en-li2，DU Na1，XI Jing2，HAN Shun-yu1，SHENG W en-jun1，NIU Li-li1，YANG Xue-shan2，*
（1.Colleage of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.College of Life Science&Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Sheep b lood as the research material and the yield of heme was measure ind icate.Orthogonal array design generated based on sing le-factor experiments was em p loyed to op tim ize cond itions.The extraction factors such as the amount of enzyme，pH，react tem perature and react time were investigated.The results showed that the op timal amount of enzyme was 8000U/g，pH8.5，react tem perature was 55℃，react time was 4h，under these op timal conditions，the yield of heme was 85.3%，that was equivalent to 3.93g heme of 1L sheep b lood.This method had higher safety than others，itwas suitab le for industrialized p roduction.

alkaline；sheep b lood；heme；p rocess condition

TS251.9

A

1002-0306（2014）18-0199-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.034

2014－01－14 *通讯联系人

祝霞（1977-），女，硕士研究生，讲师，主要从事农产品加工方面的研究。

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（GNSW-2010-03）；甘肃农业大学大学生科研训练计划项目（20130815）。