超声波结合CMC-Na对马血中血红素提取工艺效果影响

代文婷，陶永霞，杨海燕，白羽嘉，冯作山*

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052)

血红素广泛存在于动物的血液、肌肉和某些植物组织中，是一类重要的含铁天然卟啉化合物[1]，在食品、医药、化工、保健品等行业中有广泛的用途。在食品工业中，血红素可替代发色剂亚硝酸盐及人工合成色素加入火腿、灌肠等食品中，所得制品切面色泽均匀、鲜艳美观，保持肌肉固有的天然色彩，且口感韧性强、味道纯正，也降低了亚硝酸盐对人体的危害[2,3]；在医药行业中，血红素不仅是半合成法制备胆红素的前体，而且是制备抗癌、抗炎药物的重要原料[4,5]；人体对血红素铁的吸收率是无机铁的3倍[6]，在临床医学中，血红素常用作高效的补铁剂，可治疗因缺铁引起的贫血症[7,8]。

对血红素的提取已有相关报道，多以猪血、牛血、鸡血等畜禽血为原料进行提取。新疆拥有丰富的马种资源，但其开发利用深度不够，未能体现出独特的价值。本研究以马血为原料，采用超声波结合CMC-Na提取血红素，并选用Box-Behnken设计试验和响应曲面法分析试验结果，最终得到马血血红素的最佳提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

新鲜马血购买于新疆玛纳斯县屠宰场；血红素标准品（纯度98% ）Sigma公司；柠檬酸三钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、CMC-Na等均为分析纯 天津市盛淼精细化工有限公司。

JY 92-IIN 超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；JJ-2 增力电动搅拌器 江苏省金坛市医疗仪器厂；FA2104N电子分析天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；YY3009000型换膜式过滤器 美国Millipore公司；XX8200115型蠕动泵美国Millipore公司；TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；FE20型pH计 上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超声波结合CMC-Na提取马血血红素

试验在王超英[9]的基础上，进行工艺改进，得到提取的工艺流程：新鲜马血→加入柠檬酸三钠 (8g/L)抗凝[10]→搅拌→4000r/min离心10min分离RBC→RBC中加入0.9%的生理盐水离心两次→加入去离子水溶血，搅拌均匀→超声波破碎→调溶液pH值，使之达到珠蛋白和血红素分离的最佳值，并连续搅拌2h→膜分离（流速1.7m/s，压力 0.05MPa）→调节溶液 pH值→加入 CMC-Na(1.2%)悬浮液吸附，连续搅拌 2h提取血红素→高速离心，分离出血红素→洗涤，干燥→血红素。

1.2.2 血红素产率计算公式[11]：

血红素总含量/g=提取样品总质量×样品中血红素纯度

式中：m 为称取样品的质量；V 为血红素溶液体积，即100mL。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 超声功率对血红素产率的影响

RBC投料量为50mL，超声时间为10min、去离子水的添加量为RBC的5倍、提取pH为5.5、CMC-Na添加量为10mL的条件下，考察超声功率分别为195、260、325、390W时对血红素产率的影响。

1.2.3.2 超声时间对血红素产率的影响

RBC投料量为50mL，超声功率为325W、去离子水的添加量为RBC的5倍、提取pH为5.5、CMC-Na添加量为10mL的条件下，考察超声时间分别为5、10、15、20min时对血红素产率的影响。

对于有单独公猪舍的猪场，应想法使公猪舍的室温保持在13℃～20℃，或者把公猪放入后备舍或妊娠母猪舍以维持公猪需要的适宜温度，减轻降温对公猪的影响。

1.2.3.3 去离子水的添加量对血红素产率的影响

RBC投料量为50mL，超声功率为325W、超声时间为10min、提取pH为5.5、CMC-Na添加量为10mL的条件下，考察去离子水的添加量分别为RBC体积的2、3、4、5、6、7倍时对血红素产率的影响。

1.2.3.4 提取pH对血红素产率的影响

RBC投料量为50mL，超声功率为325W、超声时间为10min、去离子水的添加量为RBC的5倍，CMC-Na添加量为10mL的条件下，考察提取pH分别为4.5、5、5.5、6时对血红素产率的影响。

1.2.3.5 CMC-Na的添加量对血红素产率的影响

RBC投料量为50mL，超声功率为325W、超声时间为10min、去离子水的添加量为RBC的5倍，提取pH为5.5的条件下，考察CMC-Na的添加量分别为5、10、15、20、25mL时对血红素产率的影响。

1.2.4 响应曲面设计试验

根据单因素试验结果，利用Design-Expert 8.06软件进行响应曲面设计，优化血红素的提取工艺。试验设计如下：

表1 响应面分析因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

超声功率对血红素产率的影响结果见图1。

图1 超声功率对血红素产率的影响Fig.1 The influence of ultrasonic power on the yield of heme

由图1可知，超声功率对血红素产率的影响比较显著，随超声功率的不断增加，血红素的产率呈先上升后下降的趋势，当超声功率调至325W时，血红素产率达到最大值；当超声功率大于325W时，血红素产率呈下降趋势，可能是因为超声波空化效应虽有助于红细胞破碎，但随其强度增大及超声还引起一定的化学反应导致血红蛋白变性凝聚[12,13]，致使血红素的释放受阻，进而影响了血红素的产率。综合考虑生产过程中的各种因素，超声波功率设定为325W。

2.1.2 超声时间对血红素产率的影响

超声时间对血红素产率的影响结果见图2。

图2 超声时间对血红素产率的影响Fig.2 The influence of ultrasonic time on the yield of heme

由图2可知，超声时间对血红素产率影响较大，随超声时间的增加，血红素的产率呈先上升后下降的趋势，在10min时达到峰值，随超声时间的延长，产率开始下降。产生此现象可能是因为超声达到一定值后，空化趋于饱和，再延长超声时间会产生大量无用气泡，降低了空化强度，进而影响了血红素的产率。综合考虑实际生产中各种因素，超声波时间选择10min比较适宜。

2.1.3 去离子水的添加量对血红素产率的影响

去离子水的添加量对血红素产率的影响结果见图3。

图3 V去离子水/VRBC对血红素产率的影响Fig.3 The influence of deionized water/RBC (v/v) on the yield of heme

由图3可知，去离子水添加量对血红素提取影响较大，产率随去离子水添加量的增加，呈先上升后下降的趋势。当去离子水的添加量为RBC的5倍时，产率达到最大值，而后开始缓慢下降。这种现象可能是随去离子水的添加，红细胞内外渗透压差逐渐增大，红细胞吸水致细胞膜胀裂，利于其中血红蛋白的释放，但达到峰值后再继续增加去离子水的体积，整个提取液的浓度降低，一定程度上抑制了CMC-Na对血红素的吸附。所以综合考虑实际生产中各种因素，选取去离子水的添加量为RBC体积的5倍比较适宜。

2.1.4 提取pH对血红素产率的影响

提取pH对血红素产率的影响结果见图4。

图4 提取pH对血红素产率的影响Fig.4 The influence of extraction pH on the yield of heme

由图4可知，提取pH对血红素产率有一定影响，随提取pH值的增大，血红素产率呈先上升后下降的趋势。当提取液pH为5.5时达到峰值。这种现象可能是由于血红素卟啉对脂质双分子层有亲和作用，当pH值在4.0～6.0时，卟啉与脂质双分子层掺和量最小，此时卟啉分布率最高，故提取液的pH值选取5.5较适宜。

2.1.5 CMC-Na添加量对血红素产率的影响

CMC-Na添加量对血红素产率的影响结果见图5。

图5 CMC-Na添加量对血红素产率的影响Fig.5 The influence of amount of CMC-Na on the yield of heme

由图知，血红素产率随CMC-Na添加量的增加呈先上升后下降的趋势，当添加量为10mL时达到峰值。经方差分析，添加量对血红素产率没有显著性影响（P>0.05），因此在响应曲面试验设计中不再把CMC-Na添加量作为一个因素考虑。

2.2 响应曲面设计试验结果

2.2.1 响应曲面结果分析

表2 试验设计与结果Table 2 Trial design and results

利用Design-Expert 8.06软件对试验数据进行回归拟合，建立血红素产率与以上四个因素的二次多项回归模型：

表3 响应面试验方差分析Table 3 Variance analysis of the response surface test

注：**.P<0.01，差异极显著；*.P<0.05，差异显著。

对回归模型进行方差分析，模型P<0.01，表明回归模型极显著；模型的一次项A、B、C均极显著，D不显著；二次项均极显著；交互项BC极显著，AB、AC、AD、BD和CD均不显著。以上表明，各因素对血红素产率的影响不是简单的线性关系。失拟项P=0.4236＞0.05不显著，相关系数R2=0.9637，说明模型拟合程度良好，可用来分析和预测超声波结合CMC-Na提取血红素的结果。四因素对血红素产率的影响顺序为：超声功率＞V去离子水/VRBC＞超声时间＞提取pH。

2.2.2 因素间的交互作用

采用Design Expert 8.06软件分析并绘制响应面图，如图6-图11所示。

图6 超声功率与超声时间对血红素产率交互影响的响应面分析图Fig.6 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic power and ultrasonic time

图7 超声功率与去离子水和RBC体积比对血红素产率交互影响的响应面分析图Fig.7 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic power and deionized water/RBC (v/v)

图8 超声功率与提取pH对血红素产率交互影响的响应面分析图Fig.8 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic power and extraction pH

图9 超声时间与去离子水和RBC体积比对血红素产率交互影响的响应面分析图Fig.9 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic time and deionized water/RBC (v/v)

图10 超声时间与提取pH对血红素产率交互影响的响应面分析图Fig.10 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of ultrasonic time andextraction pH

图11 去离子水和RBC体积比与提取pH对血红素产率交互影响的响应面分析图Fig.11 Response surface analysis plots for heme yield as the interaction of deionized water/RBC (v/v) and extraction pH

2.2.3 验证试验

经分析，最适条件值为超声功率336.24W、超声时间9.33min、去离子水的添加量是RBC的5.15倍、提取pH5.51，在此条件下血红素的预测产率约为0.42g/50mL。考虑到实际操作的便利，将提取工艺修正：超声功率为338W、超声时间为10min、去离子水的添加量是RBC体积的5倍、提取pH为5.5。采用修正后的工艺参数进行3次平行验证试验。血红素产率分别为0.42、0.43、0.41g/50mL，血红素产率试验均值为0.42g/50mL，与模型预测值相差不大，可见该模型可以较好地反映出超声波结合CMC-Na提取血红素的条件。

3 结论

在单因素试验基础上，通过Design-Expert软件，采用Box-Behnken 试验设计法对超声波结合CMC-Na提取马血中血红素工艺进行设计并优化，建立了提取血红素的二次多项数学模型，优化了提取工艺条件，得出最佳工艺条件：超声功率为338W、超声时间为10min、去离子水的添加量是RBC的5倍、提取pH为5.5时，血红素产率达到最大值0.42 g/50mL，与预测值0.42g/50mL基本一致，说明响应面法适用于对超声结合CMC-Na提取马血血红素进行参数优化。

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