大鼠多器官彗星试验方法的验证研究

周长慧，韩天娇，黄鹏程，马 璟，常 艳

(中国医药工业研究总院/上海益诺思生物技术股份有限公司，上海 201203)

体内彗星试验近几年来受到广泛关注，国际上多个监管机构如食品化学诱变委员会、美国食品药品监督管理局药品评价和研究中心、欧洲食品安全局、人用药品注册技术要求国际协调会和欧洲医药管理局推荐应用体内彗星试验对体内或体外遗传毒性试验结果进行追加补充。其中人用药品注册技术要求国际协调会议(International Council for Harmonization，ICH)已于2011年将体内肝脏彗星试验列入S2R1指导原则中，将其作为体内试验第2个首选终点[1]。但一项试验投入正式应用之前需要经过大量的验证，因此2006年由日本替代方法验证中心牵头，与美国国家替代毒性试验方法评价中心、欧洲替代方法验证中心和日本环境诱变剂学会/哺乳动物致突变性研究组共同组织彗星试验的联合验证，该验证的成功完成为制定标准的试验方案和OECD试验指导原则打下了基础[2]。2014年OECD体内碱性彗星试验指导原则TG489发表[3]。

彗星试验具有如下优点[4]：①该试验测定的是单个细胞水平的DNA损伤，故敏感性相对较高；能够测定多种感兴趣的组织或器官的遗传毒性[5-7]；②进行分析所需的细胞数目相对较少；③检测谱较宽，能够测定如DNA单链断裂、DNA双链断裂及碱性不稳定位点等在内的DNA损伤[8]；④试验的数据结果采集可在试验结束隔日进行，数据的收集过程较短；⑤该试验耗时相对较短，并且试验成本相对较低。

相比国外对体内彗星试验的广泛研究，国内对该项试验的标准化研究相对较少。本研究旨在采用多个不同作用机制的化合物(1个遗传毒性化合物对氯苯胺、1个非遗传毒性化合物氯化钠、1个肝毒性化合物对乙酰氨基酚、1个肾毒性化合物庆大霉素)验证本实验室前期建立的大鼠体内多器官(肝、胃和肾)的碱性彗星试验方法[9]，研究靶器官毒性化合物因细胞毒性可能对彗星试验结果的影响，拟为国内多个GLP实验室对该方法的联合验证提供技术支撑，也有望为该方法在新药遗传毒性评价领域的推广提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

对氯苯胺、氯化钠、对乙酰氨基酚、甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate，EMS)，均购于Sigma公司；庆大霉素，购于国药集团化学试剂有限公司。Comet Assay®试剂盒、电泳仪，均购于美国Trevigen公司，SYBR®Gold染液购自加拿大Invitrogen公司，40μm孔径微孔滤膜为美国BD Falcon；X51型显微镜购自Olympus公司。

1.2 动物、分组处理和取材

每个受试物使用SPF级雄性SD大鼠25只，7～9周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。在温度20～26℃、湿度40%～70%、12 h/12 h明暗周期的饲养室，每笼饲养5只大鼠，用SPF大小鼠维持饲料，自由进食和饮水。每天给予受试物之前，EMS采用生理盐水稀释至20 mg/mL，庆大霉素采用生理盐水稀释至80、40和20 mg/mL，氯化钠采用去离子水配制成至50、100和200 mg/mL，对乙酰氨基酚采用0.5%CMC-Na重悬至2、10和50 mg/mL，对氯苯胺采用玉米油重悬至3.75、7.5和15 mg/mL。除庆大霉素肌肉注射外，其他均经口灌胃给予受试物，体积为10 mL/kg。

每个受试物的实验动物适应1周后，随机分成5组，每组5只动物，分别为阴性对照组、阳性对照组和低、中、高剂量受试物组。受试物和溶剂对照品分别在第1天、第2天(约24 h后)和第3天(约21 h后)给予动物，阳性对照品(EMS)仅给药2 d(第2和第3天)。每天给予受试物前称体质量，在最后一次给予受试物约3 h后，动物经戊巴比妥钠(30～45 mg/kg)麻醉放血安乐死后进行肝脏、胃和肾脏的组织取样。

1.3 单细胞悬液制备和制片

将胃沿胃大弯剪开，用冷的无钙镁的PBS清洗胃部；用冷的剪切缓冲液[将20 mmol/L EDTA-Na2溶于一定量的Hank’s缓冲液(无钙、镁和苯酚)中，待充分溶解后，应用5 mol/L氢氧化钠溶液和6 mol/L盐酸溶液将溶液pH值调至7.5，并将溶液置于2～8℃冰箱中保存以备用，在用前加入10%DMSO]清洗胃，弃去前胃部分，腺胃浸于现配冷的剪切缓冲液15～30 min；胃表面上皮用塑料刮板刮几次后用冷的剪切缓冲液充分冲洗；用不锈钢轻轻刮胃黏膜5～10次以释放细胞；用3 mL剪切缓冲液将刮下的细胞制成单细胞悬液，轻轻吹打约15次，经40μm滤膜过筛得上清液用于制片。

取每只动物的肝左叶中间部分，用冷的剪切缓冲液冲洗，其中仅对乙酰氨基酚实验中剩下的肝左叶部分用10%福尔马林固定用于病理检查。取每只动物的一个肾脏进行彗星试验，先将肾脏表面一层膜弃去，沿皮质大弯中心处剪掉约5 mm3的组织。其中仅庆大霉素实验中彗星取材剩余的肾脏和另一个肾脏将用10%的福尔马林固定用于病理检查。取下的新鲜肝组织和肾脏用剪刀剪碎以释放细胞，经40μm滤膜过筛得上清液用于制片。

用冷的剪切缓冲液将肝、胃和肾细胞浓度调至(2.0～4.0)×105个/mL。取上述制备好的肝脏单细胞悬液与0.5%低熔点胶混合加样于彗星玻片的孔中。每只动物至少平行制片2孔，同一动物的平行样品不在同一张玻片上。

1.4 裂解、解旋、电泳和分析

将制备完成的玻片浸入裂解液中，置于2～8℃冰箱避光过夜裂解。然后将其置于碱性解旋液中解旋后，采用Trevigen电泳系统进行电泳(保持电泳的电压为0.7 V/cm，电流约为300 mA)。电泳后，玻片经中和、干燥后室温保存待分析。玻片经SYBR Gold®染液染色后，采用连接彗星显像分析系统(Comet Assay IV)的荧光显微镜阅片分析。每只动物分析150个细胞(即每孔75个细胞)的尾部DNA百分率，并记录期间的刺猬细胞(头小、尾巴大、分布松散的细胞)数目。

1.5 数据分析

计数参与彗星试验的动物肝、胃和肾细胞每孔尾部DNA百分率的中位数和平均数，并计算每只动物两孔或多孔尾部DNA百分率的中位数和平均数的均值，结果以表示。

受试物各剂量组的尾部DNA百分率均分别与各自溶剂对照组的尾部DNA百分率性别区分进行统计分析比较，采用如下方法进行统计：①用Levene's检验检测数据的方差齐性，如方差齐，则进行单因素方差分析(ANOVA)；当方差不齐，则采用Dunnett T3检验进行组间比较(0.05和0.01水平)。②当方差分析结果有统计学意义，则进一步用Dunnett t检验进行组间比较；当方差分析结果无统计学意义，则统计结束。阳性对照组的尾部DNA百分率与溶剂对照组的尾部DNA百分率性别区分比较采用独立样本t检验，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 一般情况观察

实验过程中未见死亡或濒死动物。对氯苯胺≥37.5 mg/kg剂量组动物出现四肢颜色发暗发凉；≥75 mg/kg剂量组动物还可见眼周分泌污染物；150 mg/kg剂量组动物的活动度减少。对乙酰氨基酚500 mg/kg组个别动物出现活动度减少外，其余动物均未见其他明显异常。氯化钠和庆大霉素各剂量组动物未见明显异常的临床症状。

2.2 组织病理学检查

本研究对肝毒性化合物对乙酰氨基酚处理组动物的肝脏和肾毒性化合物庆大霉素处理组动物的肾脏进行了病理结果分析。其中，对乙酰氨基酚20 mg/kg处理组有1只动物肝脏出现轻微的单细胞炎症反应；100 mg/kg处理组有2只动物出现轻度局灶性炎症、单细胞坏死；500 mg/kg处理组有4只动物肝脏出现单细胞炎症、坏死肿胀等病理变化。图1和图2分别为100和500 mg/kg对乙酰氨基酚引起的肝脏病理变化。庆大霉素由于剂型限制，在最大可行处理剂量80 mg/kg水平下肾脏组织病理学未见改变。

图1 100 mg/kg对乙酰氨基酚处理组大鼠的肝脏组织病理学改变

图2 500 mg/kg对乙酰氨基酚处理组大鼠的肝脏组织病理学改变

2.3 彗星试验结果

对氯苯胺37.5 mg/kg组动物肝、胃和肾的尾部DNA百分率均值(即中位数的均值)与溶剂对照组相比差异无统计学意义(P均＞0.05)，75和150 mg/kg组产生的尾部DNA百分率均值与溶剂对照组相比均增加(P＜0.05)，见表1。

氯化钠的剂量高至2 000 mg/kg，其肝、胃和肾的尾部DNA百分率均值与溶剂对照组相比差异亦无统计学意义(P均＞0.05)，见表2。

对乙酰氨基酚的3个剂量组与溶剂对照组相比，大鼠肝、胃和肾的尾部DNA百分率均未出现显著性增加，但中剂量(100 mg/kg)组动物的胃和肾脏分别出现1个和4个刺猬细胞，高剂量(500 mg/kg)组动物肝脏、胃和肾脏分别出现了4个、1个和7个刺猬细胞；阳性对照EMS组大鼠肝脏、胃和肾脏分别出现了5、13和10个刺猬细胞，见表3。

表1 对氯苯胺处理组大鼠肝脏、胃和肾脏的尾部DNA百分率(%，)

表1 对氯苯胺处理组大鼠肝脏、胃和肾脏的尾部DNA百分率(%，)

与溶剂对照组相比，*P＜0.01.

组别溶剂对照组对氯苯胺37.5 mg/kg 75 mg/kg 150 mg/kg阳性对照组(EMS)肝0.31±0.56 2.28±1.82 11.38±2.19*13.45±2.82*16.65±1.51*胃0.68±0.36 2.4±1.93 10.3±7.84*11.5±3.26*22.10±2.55*肾1.17±0.63 1.18±1.71 10.11±4.54*14.23±6.48*22.17±4.01*?

表2 氯化钠处理组大鼠肝脏、胃和肾脏的尾部DNA百分率(%，)

表2 氯化钠处理组大鼠肝脏、胃和肾脏的尾部DNA百分率(%，)

与溶剂对照组相比，*P＜0.01.

组别溶剂对照组氯化钠500 mg/kg 1 000 mg/kg 2 000 mg/kg阳性对照组(EMS)肝0.92±0.64 0.09±0.05 0.33±0.37 0.14±0.19 13.25±1.75*胃0.92±0.61 0.72±0.41 0.35±0.31 0.79±0.39 18.46±0.39*肾0.39±0.27 0.21±0.21 0.86±0.77 0.46±0.28 11.62±1.64*

表3 对乙酰氨基酚处理组大鼠肝脏、胃和肾脏的尾部DNA百分率和刺猬细胞数

庆大霉素的3个剂量组与溶剂对照组相比，肝、胃和肾的尾部DNA百分率差异无统计学意义(P均＞0.05)，见表4。

表4 庆大霉素处理组大鼠肝脏、胃和肾脏的尾部DNA百分率(%，)

表4 庆大霉素处理组大鼠肝脏、胃和肾脏的尾部DNA百分率(%，)

与溶剂对照组相比，*P＜0.01.

3 讨论

对氯苯胺的Ames试验和体外染色体断裂试验呈阳性，小鼠体内微核试验呈阳性且小鼠多个靶器官的彗星试验结果也呈阳性[10]，因此应用对氯苯胺进行大鼠体内彗星试验的验证。对氯苯胺的彗星试验结果与预期相符，灌胃给予受试物3次，75和150 mg/kg处理组大鼠肝脏、胃的尾部DNA百分率与阴性对照组相比明显增加，该试验结果与国际联合验证结果相符[11]；75和150 mg/kg处理组大鼠肾脏尾部DNA百分率与阴性对照组相比明显增加，且无该化合物肾脏靶器官的相关报道。因此，对氯苯胺的大鼠体内碱性彗星试验结果呈阳性。

氯化钠是已知的非遗传毒性化合物，常作为试验溶剂。本试验中，参考联合验证的剂量(2 000、1 000和500 mg/kg)，结果显示3个剂量组的尾部DNA百分率与阴性对照组相比差异均无统计学意义，该结果与彗星联合验证结果一致。因此，氯化钠的彗星试验结果呈阴性。

刺猬细胞是在形态上“头很小但尾巴很大分布很散”的细胞[12]，目前国际上对刺猬细胞作为遗传毒性或细胞毒性的标志出现分歧，当试验结果中出现了刺猬细胞或彗星试验结果呈阳性时需要判断是否细胞毒性对彗星试验结果产生影响。因为具有特定靶器官毒性化合物的细胞毒性可能对彗星试验结果评判有影响，IWGT建议应采用评价细胞毒性的金标准——病理检查进行排除[13-14]。

对乙酰氨基酚是已知的肝毒性化合物，文献报道[15]对乙酰氨基酚在625 mg/kg剂量水平下，作用6和12 h后，大鼠出现明显的肝脏组织病理学改变，故本课题乙酰氨基酚的低、中和高剂量分别设置为20、100和500 mg/kg。具有肝脏毒性的对乙酰氨基酚各剂量组均出现了刺猬细胞，病理结果显示100和500 mg/kg剂量组都出现了不同程度的肝脏细胞炎症反应及细胞坏死等变化。但对乙酰氨基酚各个剂量3个组织器官的尾部DNA百分率与阴性对照相比差异均无统计学意义，因此在乙酰氨基酚的彗星试验结果呈阴性。

由于剂型的限制，庆大霉素注射液的最大剂量为80 mg/kg，有文献报道[16]该剂量的庆大霉素在处理7和14 d，大鼠肾脏出现明显的病理改变(如明显局灶性肾小管上皮细胞变性坏死、局灶性肾小管嗜碱性变、不同程度眼形细胞浸润和局灶性肾小管扩张等)。但在该剂量下，肌肉注射庆大霉素3 d，肾脏病理学没有改变；庆大霉素20、40和80 mg/kg各剂量组尾部DNA百分率与阴性对照组相比并无显著性增加，因此在本试验条件下庆大霉素注射液的彗星试验呈阴性。

考虑到这4种化合物的组织特异性和作用方式，本研究通过应用不同机制的化合物对体内碱性彗星试验方法进行了验证。其中对氯苯胺的彗星结果呈阳性，氯化钠、对乙酰氨基酚和庆大霉素的彗星结果呈阴性，结果与预期一致，证明了该试验方法具有较好的灵敏度和特异性。本研究中使用3 d给药试验设计可以很容易地将细胞遗传学损伤和DNA损伤终点整合到一项研究中。与国际彗星试验联合验证相比，增加了肾脏DNA损伤的评价，并研究化合物产生靶器官毒性的同时是否能够引起DNA损伤，可为国内机构的联合验证提供技术支持。综上所述，体内多器官彗星检测是检测一系列DNA损伤剂的有效方法，具有广泛的适用性。