陕西榆林地区马铃薯腐烂茎线虫的特异性分子鉴定

付 博，王家哲，任 平，李英梅，张 锋

(1. 陕西省生物农业研究所 陕西省植物线虫学重点实验室，陕西 西安 710043；2. 陕西省酶工程技术研究中心，陕西 西安 710600)

2015年1月，我国农业部提出了马铃薯主粮化发展战略，力争通过扩大种植面积、提效增产，使马铃薯成为我国的第四大主粮作物[1,2]。陕西北部(包括榆林和延安)地处黄土高原，马铃薯是当地主要粮食作物和经济作物，是近年来当地农民增收和精准扶贫的首选优势产业，仅2017年陕北地区的马铃薯种植面积就达到了23.1万hm2，占全省马铃薯总面积的60%[3]。马铃薯腐烂线虫(Ditylenchus destructor)是危害马铃薯块茎的重要检疫性有害生物，一般可造成马铃薯减产20%～50%，严重时可达100%，严重影响了马铃薯的产业发展[4～6]。该病害在其他国家和地区也均有发生，并可在甘薯上引起严重病害，一般引起甘薯田块减产30%～50%，严重时绝产绝收[7]。目前，我国对马铃薯腐烂茎线虫危害的相关研究报道较少，对榆林地区马铃薯线虫病害的研究尚未见报道。

马铃薯腐烂茎线虫的鉴定方法，主要包括形态学分析(镜检形态观察和数据测量)和分子生物学检测(对rRNA-ITS区序列进行比对分析)[8]。由于线虫形态具有复杂和重叠交错的特点，在种水平和生物型上很难区分，因此分子诊断逐渐成为植物线虫研究的新途径[9, 10]。近年来，国内外的研究报道显示马铃薯腐烂茎线虫存在种群分化现象，Subbotin等人对全球范围内已报道的78个马铃薯腐烂茎线虫的rRNA-ITS区序列和28S rRNA-D2/D3区序列进行聚类，结果显示基因序列和长度在不同群体间存在明显差异，并将马铃薯腐烂茎线虫划分为7个生物型，主要为A型和B-G型两个分支，除G型外，其他6种生物型在中国都有分布，表明马铃薯腐烂茎线虫在我国的分布具有遗传多样性丰富的特征[11]。王金成等通过对马铃薯腐烂茎线虫7个地理群体的ITS序列分析，证明了我国的马铃薯腐烂茎线虫种群主要分为A型和B型2个分支[12]。

随着马铃薯产业的不断发展扩大，线虫为害风险也日渐增加，明确马铃薯线虫病的发生情况和线虫种群类型，对有效防控该病害具有重要意义。笔者研究采用特异性分子生物学检测方法，对陕西榆林地区的马铃薯腐烂茎线虫进行种类鉴定，明确该地区线虫病害的种类并分析群体系统发育关系，为马铃薯腐烂茎线虫病的快速诊断和及时防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试虫源 马铃薯采集自陕西榆林地区8个不同采样点，选取外表有腐烂症状，表皮皱缩、龟裂的薯块并置于4 ℃冰箱保存。将病薯切成小块浸泡于适量水中，两层面巾纸过滤12 h后收集病原线虫[13]。马铃薯的采集时间、地点见表1。

1.1.2 主要试剂及仪器 Taq PCR Master Mix(Cat. No.：B639295)、DNA marker 2000 (Cat. No.：B600335)购自上海生工。PCR仪(eppendorf Mastercycler gradient)、冷冻离心机(Sigma 1-14K)、电泳仪(Baygene BG-Power 600)、紫外分析仪(ChampGel 5000)、显微镜(奥林巴斯BX-41)等。

1.1.3 引物序列 马铃薯腐烂茎线虫PCR扩增的通用引物和特异性引物均由西安擎科泽生物技术有限公司合成，序列见表2。

表1 马铃薯采集信息

表2 PCR扩增引物

1.2 方法

1.2.1 马铃薯腐烂茎线虫DNA提取 取1滴线虫溶液至洁净的凹玻片，体视显微镜下并挑取待测线虫(每个检测样品100头虫)，放入至含有14 μL 10×Extaq Buffer，蛋白酶K(2 mg·mL-1)6 μL，ddH2O 20 μL的PCR管中，于-80 ℃冰箱冷冻保藏2 h，玻璃棒研磨2次以上。PCR运行程序：65 ℃ 90 min，85 ℃10 min，13 000 r·min-1离心1 min取上清即为马铃薯腐烂茎线虫基因组DNA[15]。

1.2.2 分子生物学鉴定 反应体系 Taq PCR Master Mix 12.5 μL，正反向引物各1.5μL，模板DNA 3 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR扩增条件： 95 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存[15]。取2 μL扩增产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，设置120 v 20 min，在凝胶成像仪中观察并照相。

1.2.3 测序及序列分析 将PCR产物送西安擎科泽生物技术有限公司进行测序，将获得的8个种群序列与GenBank中下载的7个国内外种群(EF062575、AM232227、AY987007、EF062572、FJ911551、KC923223、EF062574)的rDNA-ITS序列进行ClustalX比对分析，采用UPGMA法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 通用引物扩增马铃薯腐烂茎线虫rDNA-ITS序列的结果

分别以陕西榆林8个地区马铃薯腐烂茎线虫的总DNA为模板，采用通用引物rDAN1/ rDAN2扩增rDNA-ITS序列，结果显示8个地区种群的样本均扩增出1100 bp的条带，无940 bp的条带(图1)，判断这8个地区的马铃薯线虫病害是由B型马铃薯腐烂茎线虫引起[15]。

2.2 特异性引物鉴定马铃薯腐烂茎线虫的生物型

采用特异性引物DdS1/DdS2和DdL1/DdL2分别进行PCR，结果显示扩增出485 bp条带，无252 bp条带(图2)。采用特异性引物对陕西8个地区的马铃薯腐烂茎线虫进行分型鉴定，结果均为B型，与上述通用引物PCR扩增鉴定的结果一致。

2.3 马铃薯茎线虫rDNA-ITS序列分析

特异性引物PCR扩增产物的测序结果显示，序列1～8与马铃薯腐烂茎线虫的同源性均达到99%以上。将榆林地区8个种群的特异性引物扩增序列与GenBank中7个国内外马铃薯腐烂茎线虫种群(EF062575、AM232227、AY987007、EF062572、FJ911551、KC923223、EF062574)的rDNA-ITS序列进行ClustalX比对分析并构建系统发育树。结果显示，在亲缘关系上所有的序列聚为3个分支，获得的榆林地区8个种群中，1、2、3、4、5、8和EF062575、AM232227群体聚为一个分支，6和KC923223、EF062574群体聚为一个分支，7和EF062572、AY987007、FJ911551群体聚为一个分支，榆林地区8个地理种群的马铃薯腐烂茎线虫具有较高的亲缘关系。

3 讨论

自2012年以来笔者研究团队在陕西省植保总站的大力支持下，从陕西省榆林地区的马铃薯上发现疑似马铃薯腐烂茎线虫病害，并连续多年对陕西榆林、延安等地区的马铃薯检疫性病虫害进行了田间调查，完成了马铃薯腐烂茎线虫的人工培育、形态观察和分子鉴定、生态适应性分析等一系列工作[16]。近年来，陕西榆林地区的马铃薯产业发展迅速，但是线虫为害风险也日渐增加，为进一步明确线虫种类，实现快速诊断和有效防控，笔者研究采用特异性引物DdS1/DdS2和DdL1/DdL2进行线虫分子鉴定。研究结果表明，陕西省榆林8个地区的马铃薯线虫病害的病原线虫是马铃薯腐烂茎线虫，其生物型为B型。rDNA-ITS序列进行比对和系统发育树分析显示，这8个地区的马铃薯腐烂茎线虫具有较高的亲缘关系。

王金成等通过DNA-ITS序列分析和系统发育研究证明了我国腐烂茎线虫是1个复合种群体，明确了河北、江苏、山西、山东、安徽5个省份的甘薯上的马铃薯腐烂茎线虫包含A型和B型2种[12]。李惠霞等研究了甘肃省定西市马铃薯线虫病的病原种群分类地位，并根据形态学特征及rDNA-ITS序列分析确定该病原线虫为马铃薯腐烂茎线虫，并发现其存在B型和C型2个不同的生物型[2]。目前，我国马铃薯腐烂茎线虫存在较为严重的群体分化现象，包括了A～F 6种不同类型[11, 17]，笔者研究中鉴定的陕西榆林地区为B型马铃薯腐烂茎线虫。根据文献报道我国不同地区腐烂茎线虫群体的差异明显，说明其正处于快速进化过程，并且不同地理来源的腐烂茎线虫在抗药性、致病力、虫体大小等方面也存在差异[18～20]。

笔者研究明确了陕西榆林马铃薯腐烂茎线虫的生物型，证明了特异性引物适用于快速鉴定腐烂茎线虫A型和B型群体，为腐烂茎线虫种群的分类学、群体遗传学研究， 以及有针对性开展病害防治提供理论指导。