绒山羊环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫的鉴别诊断分析

仇薪鑫，牛华锋，贾燕青，张振仓

(杨凌职业技术学院 动物工程分院，陕西 杨凌 712100)

泰勒焦虫病史严重危害畜牧业的寄生虫病，其病原较多，主要包括环形泰勒虫(T. annulata)和瑟氏泰勒虫(T. sergenti)[1]。兽医临床常用血涂片进行染色镜检，虽然该方法简便易行，但是十分依赖鉴定工作者的临床经验，而且可能产生鉴定错误，检出率较低，影响治疗。为了对羊泰勒虫病的病原进行快速准确鉴定，笔者研究在形态学鉴定的基础上，结合分子生物学方法，根据T. annulata 30 KDa基因和T. sergent MPSP表面蛋白基因序列分别设计各自的上下游引物，进行扩增和序列分析。笔者研究对环形泰勒虫和色泰勒虫具有较高的敏感性和特异性，实际诊断中还能够对不同的病原做出快速鉴定，为准确的针对性治疗提供参考。

1 试验材料

1.1 研究对象

发生泰勒焦虫病的绒山羊血液样品，环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫阳性标准品(由甘肃省农业大学动物医学院赠送)。

1.2 试剂材料

试剂：DNA提取试剂盒，GenStar公司产品，姬姆萨染色液，10xBuffer缓冲液，四种dNTP底物，4 mmol·L-1MgCl2，Tag DNA聚合酶，双蒸水，溴化乙锭，琼脂糖等，引物由上海生工合成。

2 试验方法

2.1 血液涂片的制作和染色

绒山羊颈静脉采血，加入枸橼酸钠抗凝，-20℃保存备用。取一滴抗凝血于载玻片，另一个载玻片从侧面推片制备血图片，自然干燥，甲醇固定5 min，然后经吉姆萨染色，水洗，镜检。

2.2 羊泰勒虫PCR检测方法的建立

2.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank登录的环形泰勒虫30 kDa和瑟氏泰勒虫MPSP表面蛋白序列为模板设计引物，送上海生工合成。引物序列如下：环形泰勒虫(T. Annulata) 30 KDa 上游引物 5’-GTAACCTTTAAAAACGT-3’;下游引物 5’-GTTACGAACATGGGTTT-3’，瑟氏泰勒虫(T. sergenti)MPSP 上游引物5’-CACAGCTATGTTGTCCAAGAG-3’；下游引物 5’-TGTGAGACTCAATGCGCCTA-3’预计扩增片段长度分别为200 bp和830 bp。

2.2.2 PCR反应及鉴定 环形泰勒虫30kDa基因和瑟氏泰勒虫MPSP PCR扩增体系(20 μL)：模板，1 μL；上下游引物(10 pmol·L-1)各1 μL，2×Genestar Mix，10 μL；ddH2O, 7Μl。预设扩增参数为：94℃ 5 min；然后94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，进行35个循环；最后72℃延伸10 min。取5 μL PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳分析。

2.2.3 最适退火温度的筛选 将环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫标准DNA样品按照10-6稀释，取1μL为模板进行梯度PCR扩增，退火的梯度范围为51～59℃，确定最佳退火温度。

2.2.4 敏感性试验 将环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫标准DNA样品按照10-2稀释，按照2.2.2 PCR方法进行PCR扩增，确定合适PCR反应的敏感性。

2.2.5 引物特异性试验 利用设计的特异性引物分别以不同的DNA阳性样品(环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、吕氏泰勒虫)为模板进行特异性试验分析。

2.3 序列比对分析

将PCR进行优化，以发生血液泰勒虫病绒山羊的血液DNA为模板，获取的产物进行测序和比对分析。

3 试验结果

3.1 血涂片结果

在羊血液焦虫病流行地区，采集临床症状为贫血、黄疸的羊抗凝血样本，并做血涂片。经姬姆萨染色，镜检(镜检 1 000×)，可见羊红细胞内羊泰勒虫轮廓和其原生质呈浅蓝色。

3.2 PCR扩增体系的预扩增

用设计的环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫的特异性引物，在上述PCR扩增体系和预设的反应参数，对环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫DNA标准模板1μL进行预扩增。结果试验设计的的特异性引物能扩增出的片段大小分别为193 bp和875 bp。

M.Marker2000:1.环形泰勒虫PCR扩增产物

2.阴性对照

M.Marker2000:1.瑟氏泰勒虫PCR扩增产物

2.阴性对照

3.3 PCR反应参数中退火温度的确定

对环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫标准品DNA进行1×106稀释，进行梯度PCR扩增。从图4和图5可以看出，随着退火温度的变化产物的量也在变化。

M.Marker2000:1.51℃;2.52℃;3.53℃;4.55℃;5.55℃;6.56℃;7.57℃;8.58℃;9.59℃;

M.Marker2000:1.51℃;2.52℃;3.53℃;4.55℃;5.55℃;6.56℃;7.57℃;8.58℃;9.59℃;

对于环形泰勒虫，退火温度在54.0～57.0℃之间时特异性扩增带的亮度高，在56℃时最高。对于瑟氏泰勒虫，退火温度在53.0～57.0℃之间时特异性扩增带的亮度高，在55℃时最高。

退火温度太高或者太低都会影响扩增产物的量。因此以56℃和55℃分别作为环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫反应参数中的最适退火温度。

3.4 引物特异性试验

环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫引物分别只能够扩增对应的产物。

M.Marker2000:1.环形泰勒虫;2.瑟氏泰勒虫 3吕氏形泰勒虫

M.Marker2000:1.瑟氏泰勒虫;2.环形泰勒虫 3.吕氏形泰勒虫

3.5 敏感性试验

经紫外分光光度计测定环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫标准DNA含量分别为150 mg·L-1和170 mg·L-1。反应体系中检测标准模板DNA的最大稀释倍数为1x109，则环形泰勒虫标准模板最低检测量为0.15 fg，瑟氏泰勒虫标准模板最低检测量为0.17 fg。

M.Marker2000:1.1x101稀释;2.1x103稀释;

2.1x105稀释;2.4x107稀释;5.1x109稀释;6.1x1011稀释

M.Marker2000:1.1x101稀释;2.1x103稀释;

2.1x105稀释;2.4x107稀释;5.1x109稀释;6.1x1011稀释

3.6 序列比对分析

分别以环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫基因组DNA为模板，利用设计的各自特异性引物在最佳反应条件下(环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫的退火温度分别为56℃和55℃)进行PCR能够得到的特异性片段长度分别为193 bp和875 bp。将扩增片段测序，序列分析表明与GenBank中的环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫同源性为100%。

4 讨论

笔者研究通过血液涂片染色方法和PCR检测方法对采集的两份疑似感染泰勒虫病的羊血液样品进行检测，得出以下结论。血涂片染色镜检可见羊红细胞内虫体大小约为0.5～1.5μm，原生质呈浅蓝色，染色质呈红色，虫体呈梨籽形、环形、椭圆形、短杆形、圆点形等多形态，初步鉴定为该虫体为泰勒虫。以环形泰勒虫的30 KDa表面蛋白基因序列和瑟氏泰勒虫MPSP表面蛋白基因序列分别建立各自特异性PCR检验方法。经检测发现成功扩增出193 bp和875 bp目的片段。将扩增片段测序，序列分析表明与GenBank中注册的环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫同源性为100%。敏感性试验结果表明，建立的PCR检测方法能够检测出环形和瑟氏的最低量分别为0.15 fg和0.17 fg。

环形泰勒虫致病性较强,而瑟氏泰勒虫具有分布范围较广的特点。两种泰勒虫常在野外发生混合感染，由于形态非常相似，传统显微镜检测不能很好区分它们，笔者试验建立的绒山羊环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫的诊断方法敏感性强、检测效率高，可广泛应用于两种泰勒虫的检测，并为绒山羊环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫的研究奠定了分子生物学基础。