甘蓝型油菜EMS诱变矮秆突变体分析

李 昕,阎晋东,杨 飘,向芙江,张 维,彭武生,卓宇红,李新梅,赵小英*

(1.湖南大学生物学院植物功能基因组学与发育调控湖南省重点实验室,中国湖南长沙410082；2.湖南大学深圳研究院,中国广东深圳518057；3.湖南亚华种业科学研究院,中国湖南长沙410001；4.长沙市丰景大地农业科技有限公司,中国湖南长沙410001)

油菜是我国最主要的油料作物之一,也是我国最主要的饲用蛋白质作物之一[1],属于十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)。甘蓝型油菜(Brassica napus)是油菜中最重要的栽培种。常规的油菜品种植株较高,并且随着甘蓝型油菜杂交品种的广泛推广,油菜株高平均增加了20 cm以上[2]。高秆油菜倒伏后对油菜的生长发育影响很大,可导致减产15%～30%,严重时可达到60%以上[3]。油菜倒伏问题已经成为制约油菜机械化生产和产量提高的重要因素[4]。

植物矮秆基因资源的开发和创造是矮化品种选育的重要基础。研究表明,许多植物的矮化突变与植物激素赤霉素(gibberellin,GA)和油菜素甾醇(brassinosteroid,BR)有关,而少数植物的矮化突变与生长素(auxin)有关[5]。因此,植物矮秆基因也是研究植物激素生物合成和信号传导及植物生长发育的重要资源[6]。目前,可通过自然变异、人工诱变、杂交和生物技术等方法来产生和培育植物矮秆突变体,从而获得植物矮秆基因资源[4,6～9]。

课题组前期利用甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)(0.8%)溶液处理甘蓝型油菜玻里马胞质雄性不育系(pol cms)的保持系2B种子,筛选获得多个矮秆突变体,将其命名为Bnd1(Brassica napus dwarf 1)、Bnd2、Bnd3 等[10]。本研究对其中 Bnd2突变体的农艺性状进行了分析；利用GA和BR对突变体进行处理,分析了突变体对植物激素的响应；同时,通过杂交对矮秆性状进行了遗传分析,为油菜矮秆突变体基因的定位克隆研究提供了线索。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究用到的野生型油菜为甘蓝型油菜玻里马胞质雄性不育系(pol cms)的保持系2B,矮秆突变体Bnd2通过EMS诱变2B种子筛选获得[10]。

1.2 田间种植与管理

2017年9月于湖南宁乡关山油菜基地同时种植诱变亲本2B、矮秆突变体Bnd2、2B与Bnd2的回交F1代和F2群体。对所有实验材料进行点播育苗,待幼苗长出两片真叶后,根据幼苗的大小进行分级移栽。试验基地每小区宽2 m、长20 m、行距33 cm,每行种植10株。

1.3 农艺性状鉴定

2018年4月,于油菜成熟期对矮秆突变体Bnd2的农艺性状进行测量统计,包括株高、有效分枝高度、一次有效分枝数、主花序有效长度、主花序角果数、单株有效角果数、角果长度、每角粒数、节间距、伸长节数。随后,收取矮秆Bnd2和亲本2B植株各10株,自然风干,用于测量千粒重和单株产量。

1.4 矮秆性状遗传分析

2016年9月在湖南宁乡关山油菜基地播种亲本2B和矮秆突变体Bnd2。2017年3月以2B为母本、突变体Bnd2为父本进行回交,获得回交F1代种子；5月份将F1代种子在青海加代繁殖,套袋自交获得F2代种子。同年9月,在湖南宁乡关山油菜基地播种亲本2B、突变体Bnd2,以及F1和F2代种子,于次年成熟期测量株高。

1.5 植物激素处理

对外源激素赤霉素(GA3,购自国药集团化学试剂有限公司)和油菜素甾醇(BR,购自美仑生物技术有限公司)设定不同的浓度梯度。GA3的浓度为0 mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L和10-3mol/L。BR的浓度为0 mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L。取2B和Bnd2种子各30粒,置于同一铺满3层滤纸的培养瓶中,瓶中添加1/2 MS液体培养基10 mL(含不同浓度的GA3或BR),每个处理重复3次,播种7 d后测量各处理幼苗的下胚轴长度,并拍照。

1.6 数据分析

2 结果

2.1 矮秆突变体Bnd2的农艺性状分析

对田间种植的亲本和矮秆突变体油菜的农艺性状进行统计分析,结果显示,矮秆突变体Bnd2较诱变亲本2B显著变矮(图1,表1)。其中,诱变亲本2B的株高为168.2±7.61 cm；矮秆突变体Bnd2的株高为100.65±8.09 cm。同时,Bnd2的有效分枝高度(24.95±3.17 cm)、伸长节数(13.6±2.11)、平均节间距(6.55±1.46 cm)、主花序有效长度(52.91±7.72 cm)相对于诱变亲本2B都明显减少(表1),表明Bnd2株高降低主要是由于其有效分枝高度降低、伸长节数减少、节间距和主花序缩短。此外,Bnd2的主花序角果数、一次有效分枝数、每角粒数、角果长度、千粒重和单株产量也显著低于2B,但单株有效角果数在两者之间无显著差异(表1)。

图1 诱变亲本2B和矮秆突变体Bnd2的植株表型(A)120 d苗龄的植株；(B)成熟期植株。图中标尺均代表10 cm。Fig.1 Phenotypes of mutagenic parent 2B and dwarf mutant Bnd2(A)120-day-old plants；(B)Plants at maturity.Size bars in(A)and(B)represent 10 cm.

2.2 矮秆突变体Bnd2的矮秆性状遗传分析

为了确定矮秆突变体Bnd2的基因型,我们将诱变亲本2B、矮秆突变体Bnd2以及2B和Bnd2的回交F1和F2代,同时播种在湖南宁乡关山基地,于成熟期测量株高。株高的统计结果如图2所示。亲本2B的株高主要分布在150～169 cm(图2A)；矮秆突变体Bnd2的株高主要分布在90～109 cm(图2B)；回交F1代株高主要分布在135～144 cm(图2C),偏向于高秆,说明矮秆突变体Bnd2为隐性突变。

F2代群体236个单株株高的统计结果如图2D所示。从图片数据可以看出,在2B和Bnd2回交F2代群体中株高发生了分离,呈明显的双峰分布。在拐点附近取临界值110 cm进行卡方检验,结果发现群体中高秆与矮秆的分离比符合3︰1的理论值,表明Bnd2突变体的矮秆性状受单基因控制,且为隐性突变。

2.3 矮秆突变体Bnd2幼苗下胚轴对外源GA、BR的响应

为了确认Bnd2突变体的矮化是否与GA和BR信号通路有关,我们检测了Bnd2突变体幼苗下胚轴伸长对外源GA和BR的响应。将诱变亲本2B和突变体Bnd2播种在含有不同浓度GA3或者不同浓度BR的1/2 MS培养基中,置于连续白光下培养,7 d后测量幼苗下胚轴的长度。从图3可看出,Bnd2幼苗下胚轴比诱变亲本2B的下胚轴要短,对GA3的响应减弱,并且GA3处理不能恢复Bnd2的表型(图3A～C)；Bnd2突变体对BR的响应则增强,且BR可恢复Bnd2突变体幼苗的表型(图3D～F)。根据这些研究结果,我们推测在Bnd2突变体中GA信号通路和/或者BR合成受到影响,这为后期基因定位克隆研究提供了线索。

表1 矮秆突变体Bnd2的农艺性状统计Table 1 Agronomic characters of dwarf mutant Bnd2(±s)

表1 矮秆突变体Bnd2的农艺性状统计Table 1 Agronomic characters of dwarf mutant Bnd2(±s)

注：PH,株高；BH,有效分枝高度；NPB,一次有效分枝数；LR,主花序有效长度；NSR,主花序角果数；NSP,单株有效角果数；LS,角果长度；NSS,每角粒数；MIL,平均节间距；NEI,伸长节数；TSW,千粒重；SYP,单株产量。：平均值；s：标准偏差；n=10；*：0.01＜P≤0.05,结果达到显著水平；**：P≤0.01,结果达到极显著水平。Notes：PH,plant height；BH,effective branch height；NPB,number of effective primary branches；LR,effective length of raceme；NSR,number of siliques on raceme；NSP,effective number of siliques per plant；LS,length of siliques；NSS,number of seeds per silique；MIL,mean internode length；NEI,number of elongated internode；TSW,thousand seed weight；SYP,seed yield per plant.：Mean；s：Standard deviation；n=10；*：0.01＜P≤0.05,the result reaches the significant level；**：P≤0.01,the result reaches the extremely significant level.

Mutagenic parent 2B Dwarf mutant Bnd2 Mutagenic parent 2B Dwarf mutant Bnd2 PH/cm 168.20±7.61 100.65±8.09**BH/cm 60.81±9.68 24.95±3.17**NPB 7.60±1.43 5.80±1.08*LR/cm 62.06±4.91 52.91±7.72*NSR 61.10±3.88 49.50±10.29*NSP 255.70±69.93 169.80±57.55 LS/cm 8.28±0.38 6.88±0.37**NSS 27.81±3.12 25.57±3.64**MIL/cm 8.60±0.71 6.55±1.46**NEI 19.70±1.85 13.60±2.11**TSW/g 3.36±0.08 2.67±0.18**SYP/g 18.81±6.15 9.13±1.98**

图2 诱变亲本2B(A)、突变体Bnd2(B)、回交F1代(C)及F2代(D)群体植株的株高频率分布Fig.2 Plant height frequency distribution of mutagenic parent 2B(A),dwarf mutant Bnd2(B),backcross F1generation(C)and F2population(D)

3 讨论

我国是世界上最大的油菜生产国,油菜种植面积占世界油菜总生产面积的1/3[11～12]。随着杂交油菜的利用,油菜的品质得到显著提高,但是杂交油菜的植株高大易倒伏,易造成油菜收获指数的降低[2,13～14]。为了提高杂交油菜的抗倒伏性,科学家们通过诱变手段创制了一系列矮秆突变体。石淑稳等[15～16]利用EMS技术获得了两株矮秆植株,命名为DS-1和DS-2,株高分别为106 cm和95 cm。Wang等[17]通过EMS诱变获得一个矮秆突变体Bndwf1,该突变体苗期叶片深绿,株高仅有80～110 cm,显著低于野生型。本研究利用EMS处理甘蓝型油菜保持系2B种子,筛选获得矮秆突变体Bnd2,其株高为100.65±8.09 cm,显著低于亲本株高(表1)。遗传分析结果表明Bnd2的矮秆性状为隐性性状,且受单基因控制(图2),这为油菜抗倒伏育种提供了新的矮秆资源。

GA、BR和生长素是促进植物生长、控制株高的重要激素。目前,已报道的油菜矮秆突变体的矮化大多数与GA或者生长素信号减弱有关[5,18～23]。Liu等[18]研究发现ds-1半矮秆突变体的DS-1基因编码GA信号抑制子BnaA06.RGA,在突变体中该蛋白质VHYNP模体中保守的脯氨酸(pro)突变为亮氨酸(leu)。Zhao等[19]鉴定到一个与ds-1表型相似的半矮秆突变体ds-3,DS-3基因也编码一个在GA信号途径中起抑制作用的DELLA蛋白(BnaC07.RGA),并且与BnaA06.rga-ds突变位点一样,BnaC07.rga-ds的保守区域VHYNP中发生了一个相同的氨基酸替换(脯氨酸突变为亮氨酸),导致GA信号途径受阻,植株矮化。另外,Li和Zeng等[20～21]分别鉴定到的矮秆突变体NDF-1与bnaC.dwf,都是GA不敏感型突变体,其中NDF-1矮化是由于GA受体BnGID1的编码基因启动子发生突变,导致基因表达降低,从而使GA信号减弱；而bnaC.dwf突变体受一对隐性基因控制,株高对外源赤霉素处理不敏感,但酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)结果表明,突变体叶片与茎中内源赤霉素含量显著高于野生型T6(+/+),说明该突变体在GA信号转导途径中存在缺陷,但控制该性状的候选基因目前尚未确定。最近,Cheng等[22]通过组织培养获得一个矮秆突变体G7,该突变体中Bna.IAA7.C05基因所编码蛋白质的保守区域GWPPV突变为EWPPV,使得生长素响应相关基因的表达下调,从而导致植株变矮。Li等[23]鉴定了一个EMS诱变的功能获得型半矮秆突变体sca,进一步的研究发现,SCA基因编码生长素信号负调控因子Aux/IAA(BnaA3.IAA7),在突变体中该蛋白质第84位甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E),突变蛋白质的稳定性增加,使得生长素信号受到抑制,从而使植株矮化。本研究发现,Bnd2突变体幼苗下胚轴对GA的响应减弱,对BR的响应增强,而且BR可以恢复突变体幼苗下胚轴的表型(图3),因此推测在Bnd2突变体中GA信号和/或者BR合成受到影响。后期对该突变位点的定位克隆,将对阐明GA/BR调控油菜株型和生长发育的机制,以及培育矮秆油菜品种具有重要意义。

图3 矮秆突变体Bnd2幼苗下胚轴的伸长生长对外源GA3和BR的响应(A)对照组(-GA)及10-4mol/L GA3处理组(+GA)的2B与Bnd2幼苗表型；(B)不同浓度GA3处理后2B和Bnd2的下胚轴长度；(C)不同浓度GA3处理后2B和Bnd2中下胚轴长度与对照组(0 mol/L)下胚轴长度的比值；(D)对照组(-BR)及10-5mol/L BR处理组(+BR)的2B与Bnd2幼苗表型；(E)不同浓度BR处理后2B和Bnd2的下胚轴长度；(F)不同浓度BR处理后2B和Bnd2中下胚轴长度与对照组(0 mol/L)下胚轴长度的比值。图(B)～(C)与(E)～(F)的数据代表平均值±标准差,n=20；*：0.01＜P≤0.05,结果达到显著水平；**：P≤0.01,结果达到极显著水平。图(A)、(D)中的标尺均代表10 mm。Fig.3 Responses of hypocotyl elongation of dwarf mutant Bnd2 seedlings to exogenous GA3and BR(A)Phenotypes of 2B and Bnd2 seedlings in control group(-GA)and treatment group with 10-4mol/L GA3(+GA)；(B)Hypocotyl lengths of 2B and Bnd2 treated with different concentrations of GA3；(C)Ratio of hypocotyl length of 2B and Bnd2 treated with different concentrations of GA3to that of the control group(0 mol/L)；(D)Phenotypes of 2B and Bnd2 seedlings in control group(-BR)and treatment group with 10-5mol/L BR(+BR)；(E)Hypocotyl lengths of 2B and Bnd2 treated with different concentrations of BR；(F)Ratio of hypocotyl length of 2B and Bnd2 treated with different concentrations of BR to that of the control group(0 mol/L).Data shown in(B)～(C)and(E)～(F)are represented as mean ± SD,n=20；*：0.01＜P≤0.05,the result reaches the significant level；**：P≤0.01,the result reaches the extremely significant level.Size bars shown in(A)and(D)are represented as 10 mm.