2019冠状病毒病(COVID-19)实验室诊断方法的应用现状

杨 杰,曾凡胜,秦志强,2*

(1.益阳医学高等专科学校益阳市洞庭湖区血吸虫与病原生物控制技术重点实验室,中国湖南益阳413002；2.中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所世界卫生组织热带病合作中心科技部国家级热带病国际联合研究中心国家卫生健康委寄生虫病原与媒介生物学重点实验室国家热带病研究中心,中国上海200025)

自2019年12月起,湖北省武汉市出现多起不明原因病毒性肺炎病例。2020年1月,多位研究人员通过分离病原体并开展基因组序列测定,发现了一种能感染人的新型冠状病毒[1～2]。2020年2月11日,国际病毒分类委员会正式将该新型冠状病毒命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe scute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2),世界卫生组织将该病毒引起的疾病称为2019冠状病毒病 (corona virus disease 2019,COVID-19)。COVID-19传染性很强,短时间内就由武汉传播至周边地区并很快蔓延到全国。根据国家卫生健康委员会官方网站发布的疫情数据,截至2020年4月19日,我国累计报告确诊病例82 747例,累计死亡病例4 632例,累计治愈出院病例77 084例,多省病例数持续清零,表明中国疫情控制取得了阶段性胜利[3]。然而,全球多国已发生新型冠状病毒肺炎疫情,鉴于全球COVID-19病例的持续增多[4～7],2020年3月11日,世界卫生组织宣布2019冠状病毒病疫情已构成全球大流行。截至2020年4月19日,全球COVID-19确诊病例累计逾224万例,累计死亡病例超过15万例[8]。当前,国家卫生健康委员会已经推出了第七版新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案,旨在为现阶段临床救治COVID-19患者提供规范化的操作指南[9]。实验室检测是诊断COVID-19的重要手段,现阶段COVID-19实验室检测方法包括病原学方法、血清学检查以及一般检查。

1 病原学方法

目前,病原学方法主要是基于SARS-CoV-2核酸检测的方法,包括基因组测序与实时逆转录PCR等。

1.1 基因组测序

在2019年12月中国武汉市发现多例未知病毒感染性肺炎病例后,Lu等[10]对来自9名住院患者的支气管肺泡灌洗液和病毒分离培养样品进行了基因组测序,分别获得了完整的或部分的SARS-CoV-2基因组序列。通过分析发现SARSCoV-2与2018年在中国东部舟山采集的两种蝙蝠源性SARS样冠状病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21的同源性达88%,而与SARSCoV(约79%)及中东呼吸综合征冠状病毒(middle east respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)(约50%)的同源性相差较远。基因组测序为疫情传播早期武汉不明原因的病毒性肺炎病例的病原体鉴定提供了有力保证,为后续诊断试剂的研发以及临床救治工作的开展提供了宝贵的参考。为维护全球公共卫生安全,中国已与世界卫生组织分享在武汉发生的新型冠状病毒的基因序列信息,目前SARS-CoV-2序列已共享至中国科学院新型冠状病毒肺炎科研文献共享平台(中英文版)、新型冠状病毒国家科技资源服务系统、病毒基因组自动化鉴定云平台(VCI)等数个公共医学信息平台。虽然基因组测序诊断COVID-19的准确度高,但因测序所需仪器昂贵,所需时间较长,因此不适用于临床快速、大批量的诊断。

1.2 实时逆转录PCR

实时逆转录PCR(quantitative real-time RTPCR,RT-qPCR)在检测SARS-CoV-2感染方面具有特异性强、准确度较高等特点,并可检测出多数无相关临床症状的无症状感染者[11～14],现已被推荐为SARS-CoV-2感染确诊的金标准。RT-qPCR的检测原理一种是借助嵌入式染料(如SYBR Green)与PCR过程中产生的DNA结合,实现对PCR产物的实时检测；另一种则通过荧光标记探针进行实时检测。研究结果显示,SARS-CoV-2感染者痰液、咽拭子、血液、粪便标本中核酸扩增实验的阳性率不同。通过RT-qPCR实验比较SARS-CoV-2感染者的痰液、粪便、血液样品发现,痰液样品的阳性率最高[15～16]。而 Xie等[17]使用 3 种不同的 RT-qPCR试剂盒比较了口咽拭子和粪便样品中SARS-CoV-2核酸扩增测试的阳性比率,发现在19例患者中,9例经口咽拭子样本检测为SARSCoV-2感染,8例粪便样本检测呈病毒核酸阳性,粪便和口咽拭子检测的阳性率相近。通常,血液中阳性检出率较低,仅10%的急性期患者血液样本中可检测到病毒核酸[16]。上述统计数据表明,现有RT-qPCR检测方法可能存在漏检的问题。基于此,Chan等[18]开发了一种新的核酸检测方法——COVID-19-RdRp/Hel检测法,是针对SARS-CoV-2的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)/解旋酶(Hel)、刺突(S)和核衣壳(N)基因的RT-qPCR方法,与在超过30个欧洲实验室中使用的RdRp-P2测定法相比,阳性率提高了15.4%(P＜0.001)。不断改进的RT-qPCR方法为SARS-CoV-2感染的确诊提供了更加准确的检测手段。

此外,患者不同标本的RT-qPCR检测可以辅助分析病毒感染的进程。Chen等[19]通过RT-qPCR检测已确诊病人血液和肛门拭子中的病毒存在情况,发现6例(6/57)血液标本中可检测到病毒RNA的患者均已发展为重型COVID-19,表明血清病毒RNA与疾病严重程度密切相关；11例(11/28)肛门拭子病毒阳性患者中有8例处于重型临床阶段；同时,患者肛门拭子中的病毒RNA浓度高于血液,这表明该病毒可能在消化道中复制。Ling等[20]发现与患者口咽拭子相比,患者粪便中病毒RNA的清除速度较慢,中位延迟数为2.0(1.0～4.0)d。因此,在恢复期患者的粪便中监测病毒RNA非常重要。

综上分析可知,患者不同标本的RT-qPCR检测对SARS-CoV-2感染确诊及分析病毒感染进程具有重要作用,且RT-qPCR临床检测普及率较高,目前仍是SARS-CoV-2感染确诊不可替代的金标准。

1.3 巢式RT-PCR

巢式RT-PCR(nested RT-PCR)是利用两套PCR引物(巢式引物)进行两轮PCR扩增反应,其敏感性及准确性与RT-qPCR相似[21～23]。巢式RTPCR广泛应用于多种呼吸道病毒的临床检测。Wu等[24]利用巢式RT-PCR方法对30例SARS患者和9例对照患者的全血标本进行了SARS-CoV检测,发现巢式RT-PCR检测SARS-CoV的特异性和敏感性分别为100%和83%。Yu等[25]开发的巢式RT-PCR方法可同时鉴定包括人鼻病毒(human rhinovirus,HRV)在内的12种呼吸道病毒。2020年,Shirato等[26]开发了两种巢式RT-PCR分析方法和两种RT-qPCR方法,并将它们一起用于SARS-CoV-2感染者检测。截至2020年2月8日,该套方法已成功检测出日本25例阳性感染病例。巢式RT-PCR可作为RT-qPCR方法的补充,以提高COVID-19临床检测的准确性。

1.4 生物芯片检测

恒温扩增芯片法是在恒温(65℃)条件下利用具有链置换功能的聚合酶进行反应,使用荧光染料掺入法进行实时荧光检测,阳性样品在分析仪中会产生和实时荧光类似的S形扩增曲线。目前,人们已开发多种基于智能手机平台的恒温扩增检测法,使用简便,具有较高的实用性[27～28]。康蓓佩等[29]利用恒温扩增芯片法检测了常见的13种下呼吸道病原体,与普通培养法相比,该方法的检出率较高；而且,检测时间缩短为2～2.5 h,具备快速诊断的能力。据报道,程京团队开发的“六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒(恒温扩增芯片法)”,能在1.5 h内检测包括SARS-CoV-2在内的6项呼吸道病毒核酸,并可快速区分COVID-19和其他呼吸道疾病[30]；朗道实验室利用生物芯片阵列技术(Biochip Array Technology)新开发了可针对SARSCoV-2和SARS-CoV、MERS-CoV等其他9种呼吸道病毒的综合性检测技术[31]。总之,多种高敏感性生物芯片检测技术的开发为COVID-19确诊提供了可靠快捷的筛查方法。但是生物芯片检测技术难度和设备要求较高,目前普及率也不高,因此不适用于临床大批量的诊断。

1.5 逆转录环介导等温扩增法

当前,中国防控COVID-19的重点已由控制境内病例转向防控境外输入。境外输入人员的病毒检测工作量较大,时间要求紧,因此防控境外输入需要开发一种可以在现场快速完成筛查的诊断试剂。逆转录环介导等温扩增法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RTLAMP)是在63℃等温条件下,一步进行RNA逆转录和核酸扩增的方法。Yang等[32]在预印本平台medRxiv发表文章指出,其团队开发的RT-LAMP法可同时检测SARS-CoV-2的ORF1ab基因、E基因和N基因,且测定的灵敏度与RT-qPCR相似,所检测的208个临床标本的特异性为99%。RT-LAMP法的优点在于不需要昂贵的设备,可在30 min内快速获得结果。所以,RT-LAMP法具有协助进行入境口岸潜在感染者筛查工作的潜力。

1.6 逆转录数字PCR

我国COVID-19确诊病例已逐步减少,现阶段COVID-19无症状感染者是否会引起疫情反弹的问题备受关注。COVID-19无症状感染者的定义为无临床症状,呼吸道等标本SARS-CoV-2病原学检测阳性者[9]。据统计,COVID-19无症状感染者从医学观察开始至SARS-CoV-2核酸检测阳性的时间为1～18 d,平均6.0 d,核酸检测存在“窗口期”,且需要多次采样检测[33]。如果能通过敏感性更高的检测方法缩短COVID-19无症状感染者病毒核酸检出阳性的时间,做到“早发现、早诊断、早治疗”,对疫情防控工作将具有重要意义。逆转录数字PCR(reverse transcription digital PCR,RT-dPCR)是基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量,可直接计数出DNA分子的个数,是灵敏度极高的绝对定量方法。Dong等[34]在medRxiv发文指出,对于103例发热疑似病例,SARS-CoV-2检测的敏感性从RT-qPCR的28.2%提升到RT-dPCR的87.4%；RT-dPCR的总体敏感性、特异性和诊断准确性分别为90%、100%和93%；而且,RT-dPCR检测极灵敏,检测限仅为2个拷贝/反应。由此可知,RT-dPCR适用于低病毒载量的无症状感染者标本检测。

2 血清学检查

2.1 特异性IgM、IgG抗体检测

随着核酸检测漏检问题的发现,临床迫切需要可以弥补核酸漏检的其他检测方法。SARSCoV-2感染后机体会产生特异性抗体。IgM是机体初次免疫应答最早产生的抗体,随后机体产生IgG抗体。有研究指出COVID-19症状发作5.5 d后,IgM酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)的检测效率高于RT-qPCR方法。将IgM ELISA检测与RT-qPCR结合使用时,每位患者的阳性检出率提高至98.6%,显著高于单次RT-qPCR检测的检出率51.9%[35]。由于COVID-19发作10 d后患者血清IgM的阳性率明显增加[36],所以IgM ELISA适用于COVID-19发作10 d后患者血清样品的检测。白少丽等[37]的调查结果显示,在聚集性发病的7例COVID-19患者中,特异性IgM抗体阳性者占5例；而且在该聚集性发病群体中,有4例患者无症状,但核酸检测结果和IgM抗体检测结果均为阳性。该结果表明特异性IgM抗体筛查对于早期发现和早期隔离无症状感染者也非常重要。但是,IgM抗体筛查同样存在检测结果假阴性、敏感度不够高的问题。Li等[38]开发了一种快速简单的即时侧向流动免疫测定法,该方法可以在15 min内同时检测人血中针对SARS-CoV-2病毒的IgM和IgG抗体,从而可以检测出处于不同感染阶段的患者。使用397个RT-qPCR确诊的COVID-19患者和128个SARSCoV-2阴性的对照个体的血液样本来测量该方法的临床检测灵敏度和特异性,结果显示总体测试的灵敏度为88.66%,特异性为90.63%。此外,研究者评估了从不同类型的静脉和指尖血液样本获得的临床诊断结果,发现在指尖血液、血清和静脉血血浆各样品之间具有很高的IgM和IgG抗体检测一致性。总的来讲,与单次IgM或IgG测试相比,IgM-IgG联合检测具有更好的实用性和敏感性。它可以用于医院、诊所和测试实验室中有症状或无症状SARS-CoV-2携带者的快速筛查。

2.2 白细胞介素-6检测

经临床初步观察,COVID-19重症患者存在白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子 α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)和 γ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)等促炎性细胞因子的显著升高,表现出细胞因子风暴的特征[39]。IL-6是免疫系统在应对损伤和感染的最初反应中所表达的重要细胞因子,在急性炎症反应中IL-6处于核心地位,IL-6的升高处于细胞因子启动的非常早期,而且持续时间长,因此可用来辅助急性感染的早期诊断。Huang等[40]系统阐述了COVID-19的临床特点,通过对患者外周血的多因子检测分析发现重症监护病房(intensive care unit,ICU)患者的IL-6水平显著高于对照组。Zhou等[41]发现新型冠状病毒感染后,迅速激活病原性T细胞,产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和IL-6等细胞因子。GM-CSF会进一步激活CD14+、CD16+炎症性单核细胞,产生更大量的IL-6和其他细胞因子,从而形成细胞因子风暴,导致肺部和其他器官的免疫损伤。上述结果证明IL-6是引发COVID-19患者炎症风暴的关键因子。因此,IL-6具有成为细胞因子风暴中预警、监测和预后的生物标志物的潜力。在国家卫生健康委员会办公厅和国家中医药管理局办公室2020年2月14日联合发布的“关于印发新型冠状病毒肺炎重型、危重型病例诊疗方案(试行第二版)的通知”中,已经明确将IL-6进行性上升作为病情恶化的临床警示指标,需对重症患者及时监控。

3 一般检查

外周血一般检查是医院常规的检测项目,通过监测生化指标变化辅助早期诊断疾病以及判断预后。多项研究观察了COVID-19患者存在的生化指标变化。通过对研究结果的总结发现,多数患者外周血中的淋巴细胞计数减少,白细胞总数正常或减少,部分患者可出现嗜酸性粒细胞和CD8+T淋巴细胞减少[42～43],提示嗜酸性粒细胞减少症和淋巴细胞减少可能是COVID-19诊断的潜在指标。此外,多数重症患者C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和血清乳酸脱氢酶(serum lactate dehydrogenase,LDH)显著升高；部分重症患者白蛋白(albumin,ALB)降低,降钙素原正常[44～45],提示 ALB降低和CRP、LDH升高可能是COVID-19严重程度的预测指标。需要指出的是,一般检查项目的特异性不高,只能作为COVID-19辅助诊断或判断预后的参考指标,不能单独用于确诊。

自疫情发生以来,各种实验室诊断方法已快速发展并在临床诊断得以应用,现有的关于COVID-19的实验室诊断方法的优点和缺点的总结见表1。

4 讨论

快速、准确诊断对于COVID-19的精准治疗非常关键。当前,批准上市的新型冠状病毒肺炎检测试剂主要包括两类,一类是核酸检测试剂,一类是抗体检测试剂。核酸检测是COVID-19临床诊断主要的检测手段,其平均检测时间为2～3 h,特异性强、灵敏度较高。但是当前广泛应用的核酸检测方法存在一定缺陷。1)漏检问题。相关报道指出,通过鼻咽拭子筛查出新型冠状病毒阳性的患者中有35%在第1天通过口咽拭子检测的结果为阴性,导致在低度感染者的咽拭子中难以查见病原体,从而影响确诊[46]；2)文献报道14%的两次核酸检测阴性的出院患者出现“复阳”的现象,给COVID-19的防治带来新的问题[47]。上述核酸检测漏检或者出院后“复阳”现象的原因可能与样本采集、病毒在人体排毒时期、试剂质量以及实验者操作等因素相关。血清抗体检测能从另一个维度来反映病毒感染的情况,是对病毒核酸检测的有效补充。血清特异性IgM和IgG阳性,或恢复期特异性IgG抗体滴度较急性期升高4倍及以上,可作为核酸检测阴性疑似病例的诊断依据[9]。但是,抗体检测存在窗口期,相对核酸检测要滞后几天到几周,而且有些体液免疫功能偏弱的患者体内产生的抗体含量较低,容易造成抗体检测假阴性,因此抗体检测不能完全替代核酸检测方法。

针对目前临床的核酸诊断所出现的问题,建议从以下几方面予以加强：一是加强联合方法的应用,比如出院时增加特异性抗体指标的测定。多项研究结果表明,血清学抗体检测与核酸检查同时使用可以提高SARS-CoV-2检测阳性率[48～49]。而且,结合抗体和核酸检测可以帮助分析病毒感染的进程。例如：检测出SARS-CoV-2特异性IgM抗体且核酸检测阳性,提示是早期感染；如果IgG抗体含量较高且核酸阴性,表明存在感染并已获得一定的免疫保护；二是为了弥补采集鼻咽拭子和口咽拭子引起受试者恶心、咳嗽等不适感的不足,建议开辟SARS-CoV-2感染诊断的新途径。相关文献报道,COVID-19病人粪便样本中的SARSCoV-2核酸检测同样较准确[50],有的患者虽然14次口咽拭子和鼻咽拭子的核酸检测呈阴性,但最后粪便拭子的检测结果却是阳性[51]。尿液是一种方便快捷的取样方式,但目前尿液中病毒核酸检出率较低,仅6.9%[20]。罗格斯大学旗下RUCDR Infinite Biologics开发了一种主要通过唾液检测SARS-CoV-2的新型检测方法。通过采集60名COVID-19患者的唾液和拭子样本来测试该方法的准确性,发现病人唾液样本的检测结果与拭子的结果100%吻合[52]。基于粪便、唾液和尿液的取样途经简便、快速且无创,若能进一步提高其检出率,则可弥补现有的取样方法的不足；三是继续开发新的SARS-CoV-2检测技术。有研究组运用高分辨率质谱设备取得了COVID-19轻重症患者血清样本的蛋白质组和代谢组谱图,发现了一系列生物标志物,这有望为预测轻症患者向重症发展提供导向[53]。Broughton等[54]开发了一种基于CRISPR-Cas12的侧向流动检测技术,该检测技术可快速(＜40 min)从呼吸道拭子的RNA提取物中检测SARS-CoV-2。使用36例COVID-19患者和42例其他呼吸道病毒感染的患者对该方法进行验证,发现阳性预测率达95%,阴性预测率达100%。基于CRISPR的DETECTR(DNA Endonuclease-Targeted Crispr Trans Reporter)测定法为RT-qPCR法提供了直观、快速的替代方法；四是需要加强临床诊断检测试剂的标化问题。迄今为止,国家药品监督管理局已应急审批通过了23款新型冠状病毒检测试剂盒,其中15款属于新型冠状病毒核酸检测试剂,8款属于胶体金法抗体检测试剂。但这些试剂质量依然存在批间差异和不够稳定的问题,郭元元等[55]选取了6种核酸检测试剂对COVID-19弱阳性样品进行检测,发现部分试剂的准确性、灵敏度、重复性欠佳。因此,建议国家有关部门尽快开展COVID-19诊断试剂的质量评价,可通过制备参考物质(如核酸、血清)开展实验室室间比对,遴选出公认的优良的检测试剂,进而推广应用。

表1 COVID-19实验室诊断方法Table 1 Laboratory diagnosis for COVID-19

如前所述,虽然我国在COVID-19疫情防控方面取得了阶段性成效,但是随着COVID-19疫情在全球的不断扩散,我国输入病例明显增多,目前我国疫情防范仍处于紧张态势。现阶段我们仍需要精准防控,精准防控的关键是需要精准诊断。我们期待将来的检测产品较之前检测产品在检测时间上有明显的缩短,检测的结果也更为精准、客观,为COVID-19的临床诊治以及大规模的人群流行病学调查提供更为适宜的诊断工具。