补肾调经方基于下丘脑-垂体-卵巢轴防治雷公藤多苷所致月经不调机制研究＊

吴志明 ，史晓东 ，郭健 ，祝小波 ，徐卫东 ，罗红梅

（1.南昌大学第一附属医院中西医结合科，南昌 330000；2.江西中医药大学附属医院风湿病科，南昌 330000）

雷公藤多苷(tripterygium glycosides) 素有“中草药激素”之称，具有祛风除湿、解毒消肿、舒筋活络、通过抑制细胞与体液免疫起到免疫抗炎等作用[1]。该药对自身免疫系统疾病具有良好疗效，临床上常用于治疗系统性红斑狼疮、皮肌炎、血管炎及类风湿性关节炎等结缔组织疾病[2]。中药雷公藤有大毒，对消化系统、泌尿生殖系统、心脑血管系统及造血系统等具有明确的损害[3-5]，特别是女性生殖系统，雷公藤可抑制女性卵巢激素分泌等功能[6]，主要表现为月经紊乱，如经量减少或闭经等，严重时出现卵巢早衰。本实验通过检测分析雷公藤多苷损害的幼年雌性大鼠性激素水平、卵巢与子宫指数、下丘脑-垂体-卵巢轴中多巴胺(DA)2 受体、5-HT2 受体 mRNA 及卵巢 Smad4 基因 mRNA表达，以探讨中药方剂补肾调经方改善雷公藤多苷造成的药源性月经不调的部分机制。

1 材料与仪器

1.1 药物与试剂 雷公藤多苷片，生产规格：10mg/片，由湖南千金协力药业有限公司制备，生产批号：20170138，批准文号：国药准字 Z43020138。雌激素片，生产规格：0.625mg/片，由新疆新资源生物制药有限责任公司制备，生产批号：20161208，批准文号：国药准字H20090172。补肾调经方为我科经典方，组方为熟地黄15g、党参15g、黄芪15g、当归10g、菟丝子 10g、杜仲 10g、丹参 10g、益母草10g、淫羊藿 10g、肉苁蓉 10g、川芎 10g，黄精 15g，巴戟天10g，五味子10g 甘草6g。此方剂中所有中药饮片均由江西中医药大学附属医院中药房提供，并且配备有专业的药剂师以确保方剂的药物浓度及品质。煎煮药物时，按照每100g 中药饮片配比800ml 饮用水，按常规煎煮方法进行制备。其后，进行过滤收汁至生药2.5g/ml 量，成品储存于4℃恒温冰箱之中。蒸馏水；生理盐水；ELISA 试剂盒；原位杂交探针合成及原位杂交试剂盒，天津灏洋科技生物技术有限公司；RNA 提取试剂Trizol Reagent为Invitrogen 公司产品； 荧光定量 PCR 试剂盒购为大连TaKaRa 公司；Taq DNA 聚合酶、随机引物等。

1.2 仪器 酶标仪(ThermoElectronCorporation,Type：354)；光学显微(FA1104)；万分之一分析天平(上海精科仪器有限公司 )； 数码照相机VL-4s 型超净台，珠海市再鑫仪器有限公司；OLYMPUSBXS1，CH30 显微镜，日本奥林巴斯公司产品；实时荧光定量PCR 仪，美国ABI 公司。自动平衡离心机，湘仪离心机仪器有限公司；全自动酶标洗板机，汇松科技发展有限公司；多功能酶标分析仪，汇松科技发展有限公司；恒温培养箱；紫外分光光度计为国产上海产品； 超低温冰箱产于德国贺利氏公司；微量移液器产于德国Gilson 公司等。

1.3 动物 清洁级雌性 SD 大鼠，12 周龄，体重(250±10)g，每组 15 只。购自江西省实验动物中心。购入动物后适应性喂养10d，连续10d 阴道涂片，选择有正常动情周期的大鼠进行实验，然后进行随机分组。

2 方法

2.1 分组及模型制作 实验大鼠根据随机数字表法分为4 组，分别为模型对照组、补肾调经组、雌激素组及正常对照组；模型制作：将1g 雷公藤多苷片溶于250 ml 生理盐水配置为4mg/ml 溶液,按0.1ml/10g 体重灌胃,每日1 次，给药剂量为临床成人用量的30 倍,连续灌胃15d。

2.2 给药方法及剂量 ⑴正常对照组：正常喂食，按0.1ml/10g 体重灌服生理盐水,每日1 次,连续灌胃给药12 周。⑵模型对照组：按0.1ml/10g 体重灌服雷公藤多苷片,每日1 次,连续灌胃给药12 周。⑶补肾调经组：造模成功后，按0.1ml/10g 体重灌服补肾调经方,每日1 次,连续灌胃给药12 周。⑷雌激素组：造模成功后，雌激素组按0.075mg/10g 体重的剂量进行灌胃，每日1 次,连续灌胃给药12 周。

2.3 标本的采集与处理

2.3.1 各组大鼠末次给药结束24h 后，称取大鼠体重，应用水合氯醛对各组大鼠进行麻醉，麻醉状态下通过穿刺大鼠腹主动脉取血，所取全血置于室温下1h,之后以2000r/min 离心10min，分离血清，采用酶联接免疫吸附法检测并比较其各种性激素的血清学水平。取血结束后处死大鼠，将卵巢、子宫分别取出,剥离周围黏连组织,在电子天平上分别称取湿重,按下列公式计算卵巢指数与子宫指数。

2.3.2 多巴胺(DA)2 受体mRNA 检测 ⑴实验各组大鼠快速断头取脑，根据Paxinos 和 Watson 鼠脑立体定位图谱与李耀宇成年大鼠纹状体三维结构定位纹状体[7,8]，于冰面上解剖出纹状体，液氮速冻后快速放置于-80℃冰箱冻存; ⑵样本检测：按NCBI primer-blast 和 primer5.0 设计引物。引物序列 5′-GCTAGAGCCCCAGAGGAAGG-3′，使 用RNA 提取试剂盒提取纹状体中总RNA，按产品说明书进行实验操作，并测定RNA 浓度，总RNA 保存于-80℃温度下，以防裂解。每样本抽取2μg 的总RNA 进行反转录，实验按产品说明书进行操作，反转录的 cDNA 置于-80℃温度存放。应用SYBR Green PCR Mixtur 试剂盒，通过实时检测扩增仪进行mRNA 的定量表达。在95℃温度下预变性10min，之后置于59℃温度下进行复性与延伸60s，95℃温度下再次进行变性10s，共进行45 个循环操作。所有实验重复操作3 次。

2.3.3 5-HT2 受体mRNA 检测 各组大鼠断颈后，实验各组大鼠快速断头取脑,参照以上大鼠大脑立体定位图，在冰面上解剖出下丘脑，并用生理盐水洗去血污，液氮速冻后快速放置于-80℃冰箱冻存，测定5-HT2a 受体 mRNA 表达水平。运用RT-PCR检测大鼠下丘脑5-HT2a 受体mRNA 表达水平。

2.3.4 卵巢smad4 mRNA 检测 大鼠处死后取卵巢，生理盐水冲洗血污,液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，Samd4 引物设计，5′-AGAGCCAACACTGTG AGGA-3′,参照说明书，运用 RT-PCR 检测大鼠卵巢smad4 mRNA 表达水平。

2.4 统计学方法 本实验所得数据均使用统计软件SPSS21.0 进行分析，实验结果由均数±标准差（±s）表示，每组间用单因素方差分析，P<0.05 表示有显著性差异。

3 结果

3.1 各组大鼠卵巢、子宫指数比较 由表1 可见，模型对照组大鼠的子宫指数、卵巢指数比正常对照组明显降低(P＜0.05)，补肾调经组、雌激素组较模型对照组子宫指数、卵巢指数均有增高趋势，其中补肾调经组与模型对照组比较有显著差异 (P＜0.05)，与雌激素组比较也存在差异(P＜0.05)，具有统计学意义。

表1 各组大鼠体重、卵巢、子宫指数（±s）

表1 各组大鼠体重、卵巢、子宫指数（±s）

注： △与正常对照组比，▲与模型对照组比，＃ 与雌激素组比，* 与补肾调经组，P＜0.05

组别 样本量 体重（g）卵巢指数(mg/g.W)子宫指数(mg/g.W)正常对照组模型对照组补肾调经组雌激素组15 15 15 15 245.5±6.154 238.3±4.359 245.4±7.688 224.9±7.978 0.655±0.056▲0.381±0.036△＃*0.685±0.059▲＃0.427±0.045▲△*4.382±0.146▲2.898±0.272△＃*4.895±0.587▲＃3.012±0.534▲△*

3.2 各组大鼠血清性激素水平的变化 与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清FSH、LH、GnRH水平明显升高，血清E2 水平明显降低（P<0.05）；与模型对照组比较，正常对照组、补肾调经组及雌激素组大鼠血清FSH、LH 明显降低，大鼠血清E2 水平明显升高 （P<0.05）； 补肾调经组与雌激素组比较，补肾调经组血清FSH、LH 水平低于雌激素组，E2 水平高于雌激素组，虽未达到统计学意义（P>0.05），但提示补肾调经方治疗效果可能优于雌激素，正常对照组与补肾调经组GnRH 水平明显低于模型对照组，具有统计学差异（P<0.05）；补肾调经组PRL 低于其他各组，且具有统计学意义（P<0.05），各组大鼠血清P、T 差异无统计学意义 （P>0.05）。见表2、表3。

3.3 各组大鼠多巴胺 D2 受体、5-HT2a 受体mRNA 表达水平 对各组大鼠5-HT2a 受体mRNA的影响，模型对照组大鼠5-HT2a 受体mRNA 含量均比其他各组升高，且具有统计学意义( P<0.05)，且补肾调经组低于雌激素组，达到统计学意义( P<0.05)； 各组大鼠多巴胺D2 受体mRNA 水平比较，正常对照组大鼠多巴胺D2 受体mRNA 水平均高于其他各组，且具有统计学意义( P<0.05)，与模型组比较，补肾调经组和雌激素组大鼠多巴胺D2 受体mRNA 水平均升高(P<0.05)；说明雌激素及补肾调经方可增强大鼠多巴胺D2 受体mRNA 表达，下调 5-HT2a 受体 mRNA 表达。见表4。

表2 各组大鼠血清 E2、FSH、LH 含量的比较（±s）

表2 各组大鼠血清 E2、FSH、LH 含量的比较（±s）

注： △与正常对照组比，▲与模型对照组比，＃ 与雌激素组比，* 与补肾调经组P＜0.05

组别 样本量FSH（IU/L） LH（IU/L） E2（ng/L） GnRH（pg/ml）正常对照组模型对照组补肾调经组雌激素组15 15 15 15 16.592±1.968▲34.359±2.893△＃*20.281±3.076▲22.219±2.336▲19.687±2.228▲40.561±4.728△＃*23.463±4.425▲21.475±7.889▲94.479±9.891▲56.025±2.673△＃*93.265±4.987▲89.786±5.485▲19.562±2.116▲33.562±3.349△＃*22.889±3.506▲28.658±3.889△

3.4 各组大鼠卵巢smad4 mRNA 表达水平 与模型组比较，补肾调经组和雌激素组大鼠卵巢smad4 mRNA 水平均升高(P<0.05)；说明各治疗组可增强大鼠卵巢smad4mRNA 表达，模型组与正常对照组比较，雷公藤多苷灌胃的模型组卵巢smad4 mRNA表达水平低于正常对照组，且具有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表3 各组大鼠血清 P、T、PRL 含量的比较（±s）

表3 各组大鼠血清 P、T、PRL 含量的比较（±s）

注： △与正常对照组比，▲与模型对照组比，＃ 与雌激素组比，* 与补肾调经组P＜0.05

组别 样本量 P（ng/ml） T（ng/ml） PRL（uIU/ml）正常对照组模型对照组补肾调经组雌激素组15 15 15 15 32.189±5.988 30.893±8.006 32.336±9.298 32.008±3.125 17.238±4.701 18.028±4.306 17.098±4.526 18.123±5.406 130.948±4.136*128.387±9.884*122.368±12.885△▲＃129.146±9.662*

表4 各组大鼠多巴胺D2 受体、5-HT2a 受体mRNA 表达水平比较（±s）

表4 各组大鼠多巴胺D2 受体、5-HT2a 受体mRNA 表达水平比较（±s）

注： △与正常对照组比，▲与模型对照组比，＃ 与雌激素组比，※与补肾调经组P＜0.05

组别 样本量 5-HT2a 受体mRNA 多巴胺D2 受体mRNA正常对照组模型对照组补肾调经组雌激素组15 15 15 15 0.130±0.078▲0.150±0.051△※＃0.104±0.152▲0.125±0.072▲1.936±0.053▲＃※1.243±0.118△＃※1.391±0.261△▲1.382±0.083△▲

表5 各组大鼠卵巢Smad4 mRNA 表达比较（±s）

表5 各组大鼠卵巢Smad4 mRNA 表达比较（±s）

注： △与正常对照组比，▲与模型对照组比，＃ 与雌激素组比，※与补肾调经组P＜0.05

组别 样本量 Smad4 mRNA正常对照组模型对照组补肾调经组雌激素组15 15 15 15 0.581±0.089▲0.350±0.058△※＃0.608±0.065▲0.515±0.052▲

4 讨论

月经是子宫周期性出血为表现的一种生理现象。中医发展源远流长，纵观史料，在中医学中，并无“月经失调”这一病名的历史记载。临床上常归于 “血枯经闭”、“月经先后不定期”、“月经过少”、“月经后期”、“血隔” 等范畴。在月经的产生过程中，中医方面认为肾为主导，肾气与天癸[9-11]共同主宰，冲、任二脉与胞络相互关联，相资为用，只有肾-天癸-冲任-胞宫功能维持平衡状态下，月经才能月月来潮，如期而至。现代医学认为月经主要通过下丘脑-垂体-卵巢轴调节[12]。下丘脑内含有神经细胞及腺垂体促性腺激素细胞等，GnRH（Gonadotropin releasing hormone）由神经细胞分泌，是下丘脑-垂体-卵巢轴的启动激素； 卵泡刺激素FSH （Follicle-stimulating hormone） 与黄体生成素LH（Luteinizing hormone）由腺垂体促性腺激素细胞分泌，雌二醇由卵泡刺激素FSH 刺激卵泡分泌，卵泡刺激素还能促进卵泡生长发育及调节优势卵泡的选择作用；雄激素由黄体生成素LH 刺激卵泡细胞合成，黄体生成素还能为雌二醇合成提供底物、促使排卵及维持黄体功能； 雌激素和孕激素由卵巢分泌，雌激素能够促进子宫内膜腺体增生，促进卵泡发育,孕激素能使子宫内膜由增生期转化为分泌期。子宫内膜由内至外分为致密层、海绵层、基底层，致密层及海绵层为功能层，主要参与月经形成,子宫内膜增殖期处于月经周期的第5-14 d，下丘脑神经细胞分泌GnRH，刺激腺垂体，使腺垂体FSH 分泌增加，FSH 作用于卵巢，促使雌激素分泌增加，子宫内膜在雌激素等激素的作用下逐渐增厚，第 23-28 d 黄体萎缩，雌激素、孕激素明显下降，子宫内膜失去雌激素及孕激素作用，海绵层从基底层脱落,形成内膜碎片与血液一起从阴道排出，即为月经。雌孕激素在维持女性第二性征及生殖方面起到重要作用[13]。现代医学研究结果发现雷公藤多苷通过影响卵巢血管生成及血液供应，雷公藤多苷片灌胃小鼠模型发现卵巢血管面积明显减少，血管壁厚度增大，血液供应减少，表明雷公藤多苷片可影响卵巢功能； 同时发现雷公藤多苷可导致各级卵泡数量减少，发现黄体内脂质空泡增多，且血清发现 P 水平较低，E2 较低，FSH、LH血清升高说明雷公藤多苷片对黄体有抑制作用。

本研究结果显示，在性激素水平方面，中药补肾调经方对雷公藤多苷所致卵巢早衰大鼠血清性激素水平具有较显著的调节作用，可降低FSH、LH、GnRH 水平，提高 E2 血清水平，促进卵巢功能的恢复； 目前现代医学使用雌激素替代治疗虽可有效改善患者性激素水平，但并发症、副作用多，且停药后易反复，效果不稳定，补肾调经方治治疗效果达到甚至超过雌激素替代组，能够较好地巩固生殖内分泌功能，停药后不易反复，提高临床治疗率及患者依从性。

目前研究发现多巴胺受体主要有5 种，多巴胺D1-D5 受体，分为两大类，多巴胺D1 类受体和D2 类受体[14]，多巴胺 D1 类受体包括 D1R 和 D5R；多巴胺 D2 类受体，包括 D2R、D3R、D4R。多巴胺D1 类受体能激活腺苷酸环化酶第二信使系统，使cAMP 含量升高，且只作用于突触后DA 接受性细胞，如纹状体r-氨基丁酸GABA 中型多棘神经元。多巴胺类D2 受体与多巴胺类D1 类受体不同，D2R、D3R 不仅表达于多巴胺细胞的突触后，也表达于多巴胺能神经元的突触前。多巴胺D2 类受体具有更加复杂的功能与作用。多巴胺受体既参与中枢神经系统的活动也参与调节外周各种活动，如肾功能的调节、血压的调节、血管舒张、胃肠的蠕动、嗅觉、视觉、性活动、母性行为及各类激素调节。5-HT 位于人体大多数组织、器官中，主要位于神经元、松果体及血小板中。5-HT 通过激动不同的5-HT 受体类型，起到不同药理作用，如5-HT1、5-HT2、5-HT6 和 5-HT7 受体与睡眠-觉醒相关[15]，5-HT1a、5-HT2a 受体与抗失眠研究相关。5-HT 是控制情绪的主要物质，直接影响着人的生理和心理功能，是机体重要的神经递质之一，目前公认中枢缺乏5-HT 可能引起抑郁。5-HT 通过5-HT 受体发挥作用，其中5-HT2A 受体兴奋时可抑制厌恶反应及精神分裂[16]，而5-HT1A 受体兴奋可有抗焦虑及抗抑郁作用[17]。Osterlund 等[18]证实抑郁症大鼠脑中在与情感、认知和记忆功能有关的脑区5-HT 受体1 高度表达，而5-HT 受体2 表达降低。本实验发现补肾调经方与雌激素均能使大鼠多巴胺D2 受体mRNA 表达水平均升高及使5-HT2a 受体mRNA 表达水平下降，且具有统计学意义(P<0.05)；表明补肾调经方通可能通过增强大鼠多巴胺D2 受体mRNA 表达及下调5-HT2a 受体mRNA 表达达到治疗雷公藤多苷所致月经失调。

Smads 蛋白家族目前至少由9 位成员组成，是重要的信号转导蛋白，与TGF-B 信号转导系统共同参与细胞内信号转导,起到效应因子作用,Smads 4 为一种抑癌基因,目前研究发现其在血管瘤与脑缺血等多种血管疾病、胰腺癌与子宫内膜癌等肿瘤疾病发病中起重要作用[19-22]。本实验证实补肾调经方可上调卵巢与子宫smad4mRNA 表达，通过上调卵巢smad 基因的表达改善雷公藤多苷所致月经失调。总之，smad4 mRNA 表达的下降可能是雷公藤多苷导致雌性生殖损伤的关键点之一。

综上所述，补肾调经方治疗雷公藤多苷所致月经失调的临床效果显著，能够显著改善症状，通过调节下丘脑-垂体-卵巢轴中性激素水平、受体与基因表达水平治疗雷公藤多苷片所致月经失调，能够显著提高丘脑中多巴胺D2 受体mRNA 及卵巢与子宫内膜smad4 mRNA 表达水平，降低5-HT2a 受体mRNA 表达水平，升高血清E2 水平，降低FSH、LH、GnRH 水平,雷公藤多苷在治疗风湿性疾病中较常使用,在治疗过程中可能影响卵巢血供引起女性卵巢早衰,在大鼠模型中使用补肾调经方能够改善模型鼠的卵巢血供使得模型鼠的性激素水平与正常对照组相似,为临床治疗雷公藤多苷导致的女性卵巢早衰提供了一定的理论依据。