淫羊藿大花类群花序性状与黄酮成分含量相关性研究

秦伟瀚，危永胜，阳 勇，李 卿，刘 翔

重庆市中药研究院，重庆 400065

淫羊藿为小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属(EpimediumL.)多年生草本植物[1]，是我国常用且重要的中药材，最早记载于《神农本草经》。具有补肾壮阳、祛风除湿之功效；主要用于治疗骨质疏松、更年期综合征、乳房肿块、高血压、冠心病等症[2-6]；药理学研究证明该药材具有抗衰老、抗肿瘤、抗艾滋病等作用，因此备受国内外学者关注[7-10]。据统计淫羊藿在中国境内有超过50个种，是世界上淫羊藿属植物地理分布的中心[11]。按照花型大小可以将淫羊藿分为大花类群(花瓣远长于内轮萼片，花直径大于1 cm)和小花类群(花瓣短于内轮萼片，花直径小于1 cm)，在中国大花类群就有27种之多[12-14]。由于淫羊藿品系繁多，市场上混用的就有10余个种，仅2015年版《中国药典》就收载了5个品种[15]，药材质量参差不齐。据文献报道，小花品种的药效黄酮含量要明显高于大花[1]，但有些大花品种如朝鲜淫羊藿、巫山淫羊藿、粗毛淫羊藿等的药用品质却并不低，通过进一步研究发现大花类群的花序可以分为总状花序和圆锥状花序。花型、花序等可作为淫羊藿分类重要标准，表明该属植物调控花性状的某种基因是区分不同品种且能稳定遗传的基因[16]；淫羊藿黄酮醇成分大多具有相同母核(去甲淫羊藿素)，造成花表型与黄酮代谢具有显著相关性，可能存在某种关联关键基因在进行调控，还有待于进一步研究证明。本研究于重庆、四川、湖南、湖北、吉林等省市实地采集了33个批次14个品种的大花淫羊藿，采用UPLC-MS/MS法对14种含异戊烯基的主要黄酮醇成分进行了含量测定，探讨了大花淫羊藿花序类型与黄酮含量的相关性，为淫羊藿质量控制、品种选育等提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

LC-30A型超高效液相色谱仪(日本，岛津公司)：二元高压泵、自动进样器、柱温箱；API4000型三重四极杆串联质谱仪(美国，Applied Biosystems公司)：Analyst 1.5.2定量处理软件；BJ-100型超高速中药粉碎机(中国，德清拜杰电器有限公司)；VGT-2013QT型超声清洗机(中国，固特超声公司)；BSA224S-CW型万分之一分析天平(德国，赛多利斯公司)。

1.2 试药

对照品淫羊藿苷(批号：489-32-7)、淫羊藿次苷I(批号：56725-99-6)、淫羊藿次苷II(批号：113558-15-9)、朝藿定A(批号：110623-72-8)、朝藿定B(批号：110623-73-9)、朝藿定C(批号：110642-44-9)、箭叶淫羊藿苷A(批号：118525-35-2)、箭叶淫羊藿苷B(批号：118525-36-3)、鼠李糖淫羊藿次苷II(批号：135293-13-9)、宝藿苷II(批号：55395-07-8)、淫羊藿属苷A(批号：39012-04-9)、去甲淫羊藿素(批号：28610-31-3)、宝藿苷V(批号：118544-18-6)、粗毛淫羊藿苷(批号：143601-07-4)，质量分数均大于98%，均购于成都埃法生物科技有限公司；乙腈(色谱级，德国Merck公司)、甲酸(色谱级，美国ACS公司)，其余试剂为分析纯；水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。不同品种淫羊藿样品均采自于重庆、四川、湖北、湖南等地，经重庆市中药研究院生药研究所刘翔副研究员鉴定为小檗科多年生草本植物淫羊藿的地上部分。33批样品信息见表1。

表1 淫羊藿样品采集信息表

续表1(Continued Tab.1)

样品编号SampleNo.植物基源Botanicorigin学名Scientificname类群Phyto-group花序类型Inflorescencetype采集地点CollectionlocationS20粗毛淫羊藿E.acuminatumFranch.大花圆锥状花序重庆市武隆县白马镇S21粗毛淫羊藿E.acuminatumFranch.大花圆锥状花序重庆市南川区黄草坪S22粗毛淫羊藿E.acuminatumFranch.大花圆锥状花序重庆市武隆县蒲板乡S23粗毛淫羊藿E.acuminatumFranch.大花圆锥状花序四川省峨眉山市龙池镇S24湖南淫羊藿E.hunanenseHand.-Mazz.大花圆锥状花序湖南省新宁县紫云山S25湖南淫羊藿E.hunanenseHand.-Mazz.大花圆锥状花序湖南省新宁县S26湖南淫羊藿E.hunanenseHand.-Mazz.大花圆锥状花序湖南省新宁县S27湖南淫羊藿E.hunanenseHand.-Mazz.大花圆锥状花序湖南省新宁县S28湖南淫羊藿E.hunanenseHand.-Mazz.大花圆锥状花序湖南省新宁县S29单叶淫羊藿E.simplicifoliumYing大花圆锥状花序重庆市南川区庙坝S30单叶淫羊藿E.simplicifoliumYing大花圆锥状花序重庆市彭水县大同镇S31薄叶淫羊藿E.membranaceumK.Meyer大花圆锥状花序四川省安县S32金城山淫羊藿E.jinchengshanense大花圆锥状花序重庆市渝北区S33巫山淫羊藿E.wushanenseYing大花圆锥状花序湖北省巴东县溪丘湾乡

1.3 测定方法的建立

1.3.1 色谱条件

色谱柱为ACE Execl 3 SuperC18柱(10 mm×2.1 mm，3.0 μm)；柱温40 ℃；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，体积流量0.2 mL/min；梯度洗脱：0～2.0 min，15%乙腈；2.0～15.0 min，15%→80%乙腈；15.0～17.0 min，80%乙腈；17.0～17.1 min，80%→15%乙腈；17.1～20.0 min，15%乙腈；进样量2 μL。

1.3.2 质谱条件

质谱为电喷雾离子源：正离子模式(ESI+)；多反应监测(MRM)；离子源喷雾电压5500 V；雾化温度550 ℃；气帘气(CUR)：103.3 kPa；雾化气(GS1)：378.9 kPa；辅助气(GS2)：378.9 kPa；碰撞气(CAD)：27.5 kPa。质谱数据的相关参数见表2。样品和对照品的14种黄酮成分质谱图见图1和图2。

表2 14种黄酮成分的质谱定量分析方法

图1 14个黄酮成分标准品质谱图

1.3.3 混合对照品溶液制备

精密称取淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭叶淫羊藿苷A、箭叶淫羊藿苷B、鼠李糖淫羊藿次苷II、宝藿苷II、淫羊藿属苷A、去甲淫羊藿素、宝藿苷V、粗毛淫羊藿苷适量于100 mL容量瓶中，加甲醇-水(1∶1)溶解并稀释至刻度，得含淫羊藿苷(16 μg/mL)、淫羊藿次苷I(17 μg/mL)、淫羊藿次苷II(14 μg/mL)、朝藿定A(16 μg/mL)、朝藿定B(15 μg/mL)、朝藿定C(14 μg/mL)、箭叶淫羊藿苷A(15 μg/mL)、箭叶淫羊藿苷B(15 μg/mL)、鼠李糖淫羊藿次苷II(15 μg/mL)、宝藿苷II(17 μg/mL)、淫羊藿属苷A(15 μg/mL)、去甲淫羊藿素(15 μg/mL)、宝藿苷V(16 μg/mL)、粗毛淫羊藿苷(15 μg/mL)的混合对照品溶液，备用，低温避光保存。

1.3.4 供试品溶液的制备

取淫羊藿样品粉末约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%的乙醇水溶液20 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率：300 W，频率：40 kHz)60 min，放冷，再次称定质量，用50%乙醇溶液补足减失质量，摇匀，精密量取1 mL提取液于10 mL容量瓶中，加色谱甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过于进样瓶中，即得。

1.3.5 线性关系考察

精密吸取“1.3.3”项下的混合对照品溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，加色谱甲醇定容至刻度，摇匀后按照此方法以2倍比例逐级稀释至1.5 ng/mL；即得系列质量浓度的混合对照品溶液。分别吸取上述系列混合对照品溶液各2 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积值，并以峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)，进行线性回归，回归方程见表3。

1.3.6 精密度实验

精密吸取同一混合对照溶液(1.5 μg/mL)2 μL，重复进样6次，记录峰面积。结果显示，淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭叶淫羊藿苷A、箭叶淫羊藿苷B、鼠李糖淫羊藿次苷II、宝藿苷II、淫羊藿属苷A、去甲淫羊藿素、宝藿苷V、粗毛淫羊藿苷的峰面积RSD值分别为0.56%、1.02%、1.13%、0.49%、0.73%、1.27%、0.84%、1.42%、1.29%、0.53%、0.75%、0.77%、1.06%、1.01%，表明仪器精密度良好。

表3 淫羊藿中14种主要黄酮成分的线性方程

1.3.7 稳定性实验

精密吸取同一供试品溶液(S18号)各2 μL，按“1.3.1”和“1.3.2”项下色谱质谱条件分别于0、2、4、8、10、12、18、24 h进样检测，结果显示淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭叶淫羊藿苷A、箭叶淫羊藿苷B、鼠李糖淫羊藿次苷II、宝藿苷II、淫羊藿属苷A、去甲淫羊藿素、宝藿苷V、粗毛淫羊藿苷的平均质量分数RSD均小于1.5 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。

1.3.8 重复性实验

取淫羊藿样品(S18号)6份，按照“1.3.4”项下方法制备供试品溶液，按照“1.3.1”和“1.3.2”项下的色谱质谱条件进样检测，结果显示，淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭叶淫羊藿苷A、箭叶淫羊藿苷B、鼠李糖淫羊藿次苷II、宝藿苷II、淫羊藿属苷A、去甲淫羊藿素、宝藿苷V、粗毛淫羊藿苷的平均质量分数的RSD分别为1.33%、1.45%、1.02%、1.10%、0.78%、0.96%、1.52%、1.18%、0.55%、1.42%、1.07%、0.89%、0.91%、0.74%，表明该方法重复性良好。

1.3.9 加样回收率实验

取淫羊藿样品(S18号)6份，每份约0.05 g，精密称定，按照已知质量分数的50%加入对照品溶液，按照“1.3.4”项下方法制备供试品溶液，按照“1.3.1”和“1.3.2”项下的色谱质谱条件进样检测，计算回收率。淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭叶淫羊藿苷A、箭叶淫羊藿苷B、鼠李糖淫羊藿次苷II、宝藿苷II、淫羊藿属苷A、去甲淫羊藿素、宝藿苷V、粗毛淫羊藿苷的平均回收率分别为95.4%、97.2%、101.5%、102.3%、96.3%、97.1%、102.1%、100.8%、98.8%、99.2%、101.4%、95.8%、96.2%、101.3%，RSD分别为0.55%、1.01%、0.89%、0.98%、1.14%、0.62%、0.88%、0.75%、1.15%、0.92%、0.72%、1.24%、1.21%、0.64%，表明方法回收率良好。

2 结果与讨论

2.1 样品含测结果及与花序性状相关性探讨

取收集到的33批淫羊藿样品，按照“1.3.4”项下方法制备供试品溶液，按照“1.3.1”和“1.3.2”项下的色谱质谱条件进行进样检测，用外标法计算样品中淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭叶淫羊藿苷A、箭叶淫羊藿苷B、鼠李糖淫羊藿次苷II、宝藿苷II、淫羊藿属苷A、去甲淫羊藿素、宝藿苷V、粗毛淫羊藿苷的含量，结果见表4。根据2015年版中国药典淫羊藿项下规定，巫山淫羊藿中朝藿定C的含量不得低于1.0%[15]，课题组仅采集到了一个批次的巫山淫羊藿，其朝藿定C的含量为0.5%，未达到药典要求，可能与样品数量、气候、环境等因素相关，并不能全面反映巫山淫羊藿药材的质量；药典对淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿及朝鲜淫羊藿的淫羊藿苷的要求为不得低于0.5%[15]，本研究中所有批次样品仅朝鲜淫羊藿(0.56%)、粗毛淫羊藿(0.85%、0.59%、1.26%)、湖南淫羊藿(0.53%)达到药典要求；成分含量最高的是粗毛淫羊藿(S22)的朝藿定C，为24 282.9 μg/g，该样品总黄酮含量也是最高，为4.54%，接近药典5%的要求[15]。与课题组前期研究结果相比较，证明大花类群多个品种的药用质量同样优良。

按照大花淫羊藿花序类型对所有黄酮成分的含量进行叠加，建立黄酮生物量的柱状图(图2)，由柱状图可以看出，圆锥状花序的总黄酮含量是总状花序的10倍，说明两种花序类别的黄酮总量上有着巨大差异，朝鲜淫羊藿虽然属于大花总状，但其一个品种就占到了总状花序黄酮总量的25%。按照淫羊藿品种，将所有成分含量进行平均后，拟合出3D折线图(图3)，由该图可以看出，除了朝鲜淫羊藿外，所有总状花序品种的折线趋势都较为平坦，且与圆锥状花序品种差异明显；再按照花序类型对化学成分含量平均后拟合成2D折线图(图4)，并将朝鲜淫羊藿单列，由该图可以看出圆锥状花序、总状花序和朝鲜淫羊藿在化学成分含量及变化趋势上有明显差异。由上述结果可知，淫羊藿大花类群总状花序与圆锥状花序化学差异明显，且圆锥状花序的药用品质明显要优于总状花序品种。中国药典收录了2个淫羊藿的大花品种，一个是巫山淫羊藿(大花圆锥状)，一个是朝鲜淫羊藿(大花总状)，巫山淫羊藿被药典单列出来，检测指标由淫羊藿苷变为了朝藿定C；朝鲜淫羊藿虽然属于总状花序品种，但其药用品质同样优良，可能与独特的品种类型及生长环境等因素相关，该研究结果也佐证了药典收录两个大花品种的合理性。

图2 总黄酮含量柱状图

图3 14个大花品种样品的3D折线图

图4 总状花序和圆锥状花序样品折线图

表4 淫羊藿中14种黄酮有效成分的含量测定结果(n=3)

续表4(Continued Tab.4)

样品编号SampleNo.质量分数Massfraction(μg/g)淫羊藿苷Icariin淫羊藿次苷IIcarisideI淫羊藿次苷IIIcarisideII朝藿定AEpmedinA朝藿定BEpmedinB朝藿定CEpmedinC箭藿苷ASagittatosideA箭藿苷BSagittatosideB鼠李糖基淫羊藿次苷II2''-O-RhamnosylicarisideII宝藿苷IIBaohuosideII淫羊藿属苷AEpimedosideA去甲淫羊藿素Desmethylicaritin宝藿苷VBaohuosideV粗毛淫羊藿苷Acuminatin总黄酮Totalflavonoids(%)S245335.60.4681.15451.97552.511626.82011.7571.7601.616.8196.7-904.34.03.50S253255.6-192.13458.43701.311243.91449.6354.1737.74.7199.3-637.0-2.52S262984.5-556.22298.72679.09121.22042.7564.41339.527.7139.1-1014.5-2.28S273245.5-495.93398.04017.412677.32466.0777.9996.629.0151.4-966.7-2.92S282501.0-259.43352.34281.811262.2727.3566.9743.610.9121.3-878.4-2.47S291450.8-413.71320.51645.86026.1574.3532.11778.04.629.6-212.1-1.40S302795.54.0316.92666.73640.89946.3411.8434.91349.91.668.0-642.0-2.23S311610.9-195.5885.31631.85897.5153.7116.7399.57.1105.4-432.4-1.14S32234.0-6.5145.2115.117360.61.4-1125.5-12.3-1614.5-2.06S332972.0-111.52026.61586.15010.6259.0202.81020.3-211.9-295.61.11.37

图5 PCA(A)和PLS-DA(B)的得分图

2.2 聚类分析结果及讨论

采用无监督PCA方法对淫羊藿大花类群总状花序品种和圆锥状花序品种间进行统计学分析。结果发现PCA得分图(图5A)中总状花序(I)与圆锥状花序样品点(II、III)区分明显，说明淫羊藿大花总状花序品种的黄酮醇类成分含量与圆锥状花序品种有明显差异，由得分图可以看出大花总状花序(I)的所有数据点均聚于一处，而朝鲜淫羊藿(IIII)虽然同属于大花总状，但其数据点远离总状和圆锥状样品的聚集区域，SIMCA软件将其单独聚类，说明朝鲜淫羊藿主要有效成分与其它品种有较大差异。圆锥状花序品种被划分为了两个较集中的区域(II、III)，其中巫山、薄叶、金城山及部分粗毛和单叶淫羊藿相对比较接近(II)。为了进一步探讨两类淫羊藿之间的变量差异，利用PLS-DA进行有监督的模式识别，由PLS-DA得分图(图5B)可以看出，聚类结果与PCA分析一致。为了验证该模型的准确性、有效性，对PLS-DA进行排列检验，结果见图6；R2Y及Q2原始值分别为0.875、0.722，说明模型的拟合能力和预测能力良好，50次随机排列后R2和Q2的截距为0.171和-0.612，表明所建模型无过度拟合。同时按该模型某X变量对Y变量的解释能力(Variable influence on projection，VIP)大小进行排序(图7)，VIP值大于1的成分分别为朝藿定C、朝藿定B、朝藿定A、鼠李糖淫羊藿次苷II、淫羊藿苷、宝藿苷V，表明这些成分对分类具有重要贡献。

图6 PLS-DA的排列检验图

图7 PLS-DA的VIP图

通过PCA、PLS-DA分析可以发现，除朝鲜淫羊藿数据点外，大花类群总状花序品种(I)完全聚为一类，表明这7个总状花序品种化学成分比较相似；圆锥状花序品种又大致聚为两类(II、III)，巫山淫羊藿样品点与薄叶、金城山及部分粗毛和单叶淫羊藿较为靠近，而朝鲜淫羊藿虽然属于总状花序品种，其数据点既不靠近总状也不靠近圆锥状，SIMCA软件将其单独聚为一类，该聚类结果与含量分析结果一致，这应与朝鲜淫羊藿在淫羊藿属中归于sect.Macroceras组，而其它中国种类属于sect.Diphyllon组有关。当然由于朝鲜淫羊藿样品采集于吉林省临江市卧虎山，该地的自然环境与南方省市有较大差异，也可能是造成朝鲜淫羊藿化学成分差异的原因，当地特殊的土壤、气候、海拔、光照等因素与黄酮醇类次生代谢产物积累的相关性，还有待课题组作进一步验证。

3 结论

淫羊藿是我国一个重要的中药品种，其功效确切，为历版药典所收载，但由于品种混杂，药材质量难以得到有效控制。课题组前期研究发现，淫羊藿小花类群品种的黄酮含量要明显高于大花，但有些大花品种药用品质却同样优良[16]，进一步探讨发现，大花总状和圆锥状花序品种黄酮成分含量存在较大差异，本研究采用LC-MS/MS法对8个总状花序和6个圆锥状花序品种中14种主要黄酮成分含量进行比较分析，结果显示除朝鲜淫羊藿外，总状花序品种的药效成分含量、药用品质要明显低于圆锥状花序品种。课题组拟在后期结合转录组和代谢组的方法解析同时调控花型性状和黄酮代谢的关联关键基因，以期通过表达和过表达目的基因以提高淫羊藿的药用品质，本研究实验结果为淫羊藿质量控制、品种选育等提供科学参考。