迷迭香酸抗动脉粥样硬化作用研究

2020-06-03林晓琳张凌云

天然产物研究与开发 2020年4期

林晓琳，张凌云

1滨州医学院临床医学院；2烟台毓璜顶医院莱山分院内科，烟台264003；3滨州医学院烟台附属医院内分泌科，烟台 264100

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是指动脉内膜有脂质等血液成分的沉积、平滑肌细胞增生和胶原纤维增多，形成粥糜样含脂坏死病灶和血管壁硬化[1]。随着AS的发展，会导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死[2]。近年来，AS的发病率逐渐升高，并且也是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因，这严重威胁着人们的生活健康[3,4]。虽然AS的发病率如此之高，但是临床上还没有一种专门治疗AS的药物，目前临床上主要采用一些降脂药(如他汀类药物)治疗AS，但这远远不能有效解决AS问题。因此，寻找一种安全、低毒、有效的治疗AS药物是迫切需要的。

引起AS的原因有很多，如高脂血症和高胆固醇血症[5]。近年来，大量的研究发现，剪切力在AS的发生中起着重要的作用[6]。研究发现低剪切力是诱导AS发生的危险因素之一[7]。低剪切力会增加内皮细胞中活性氧(ROS)的活性，并降低一氧化氮(NO)的活性，造成内皮细胞功能紊乱和氧化应激，促进AS的发生[8]。因此，寻找一种可以改善低剪切力诱导的血管内皮细胞功能紊乱或降脂的药物来治疗AS可能是一条有效的策略。

迷迭香酸是一种天然的多酚类化合物，具有很好的抗炎和抗氧化作用[9,10]。很多研究已经发现，迷迭香酸对心血管有很好的保护作用，如心肌保护作用[11]，但是有关治疗AS的作用尚未报道。因此，本研究主要研究迷迭香酸的治疗AS模型作用。

1 材料

1.1 试剂

斑马鱼幼鱼基础饲料购自上海海圣生物实验设备有限公司。迷迭香酸标准品(纯度≥98%)购自成都曼思特生物科技有限公司。橙色荧光标记胆固醇标准品购自Sigma公司。胆固醇标准品、RPMI 1640培养液、胰酶和蛋白提取试剂盒均购自北京索莱宝生物科技有限公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

Z-C-D6型集中式斑马鱼养殖单元购自上海海圣生物实验设备有限公司。SZX7型奥林巴斯体视镜购自奥林巴斯公司。HH-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；LEGEND Micro 21R型离心机(Thermo scientific，美国)；BS210S电子天平(Sartorius)；细胞培养箱(HERA Cell 150)；荧光倒置显微镜(Olympus)；超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；iCycler iQ5(Bio-Rad，美国)，核酸定量仪(Amerscham biosciences，美国)，逆转录仪器(Veriti 96，美国ABI)。

1.3 动物

野生型AB品系斑马鱼、转基因型(flil:EGFP)斑马鱼和转基因型(mpx:EGFP)斑马鱼购自国家斑马鱼资源中心。

1.4 实验细胞

人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)均来源于ATCC公司。

2 方法

2.1 细胞实验

2.1.1 细胞培养

取生长状态良好的EA.hy 926细胞，使用含10%胎牛血清、链霉素(100 μg/L)、庆大霉素(100 μg/L)的RPMI 1640培养液(pH=7.5)，在37 ℃ 5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞进行各项实验。

2.1.2 血管内皮细胞功能紊乱模型建立

采用平行板流动腔建立EA.hy926细胞功能紊乱模型，造模方法与文献一致[8]，大体操作如下：将EA.hy926细胞爬片贴壁后置于可体外模拟LSS的平行板流动腔中，施加剪切力2 dyn/cm2于贴壁的细胞，作用30 min即可。

2.1.3 DHE法检测EA.hy926细胞中ROS活性

取对数生长期的EA.hy926细胞爬片，并使用不同浓度(0、0.1、1和10 mg/L)的迷迭香酸处理24 h后，进行平行板流动腔实验。平行板流动腔实验结束后，采用DHE法检测各组EA.hy926细胞中ROS活性。平行板流动腔实验结束后，取出玻片，去除培养液，用PBS洗2次，加入DHE于37 ℃培养箱中避光孵育20 min。用PBS洗三次，收集细胞，在激发波长535 nm，发射波长610 nm处，用荧光酶标仪检测荧光强度。

2.1.4 DAF-FM DA法检测细胞中NO活性

取对数生长期的EA.hy926细胞爬片，并使用不同浓度(0、0.1、1和10 mg/L)的迷迭香酸处理24 h后，进行平行板流动腔实验。平行板流动腔实验结束后，采用DAF-FM DA法检测各组EA.hy926细胞中NO活性。平行板流动腔实验结束后，取出玻片，去除培养液，用PBS洗2次，加入DAF-FM DA于37 ℃培养箱中避光孵育20 min。用PBS洗三次，收集细胞，在激发波长495 nm，发射波长515 nm处，用荧光酶标仪检测荧光强度。

2.1.5 检测细胞中ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达

取对数生长期的EA.hy926细胞爬片，并使用不同浓度(0、0.1、1和10 mg/L)的迷迭香酸处理24 h后，进行平行板流动腔实验。平行板流动腔实验结束后，提取各组细胞中的总RNA，并使用q-PCR法检测各组EA.hy926细胞中ICAM-1、VCAM-1和GAPDH。引物由Primer3 software设计与合成，引物的序列等信息将表1。细胞总RNA的提取：平行板流动腔实验结束后，取出玻片放置于培养皿中，后按照RNA提取说明书的方法采用Trizol溶液提取细胞总RNA。

RNA的逆转录反应：按照说明书配制RT反应液(5 × PrimeScript RT Buffer 2 μL，总RNA，RNase Free dH2O补足至10 μL)，置于逆转录仪中反转录成cDNA。

荧光定量PCR检测：以上述反转录cDNA为模板，应用荧光定量PCR检测细胞中ICAM-1、VCAM-1和GAPDH的基因表达。25 μL反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，灭菌双蒸水补足至25 μL。扩增条件为预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，以上两步扩增循环。每个循环结束后收集荧光信号，反应结束后确认扩增曲线和融解曲线。

表1 引物序列

2.1.6 检测细胞中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达

平行板流动腔实验结束后，使用蛋白提取试剂盒提取各组细胞的总蛋白试剂盒。将蛋白样品加入5×上样缓冲液后煮沸变性，每孔加入20 μg蛋白，70 V恒压电泳至溴酚蓝指示剂至分离胶浓缩胶分界处，转为90 V恒压电泳至指示剂接近凝胶的底部。将电泳完毕的凝胶按照从正极到负极依次为海绵垫-滤纸-膜-凝胶-滤纸-海绵垫的顺序夹好，250 mA恒流转膜，冰浴，转膜时间1 h。使用脱脂牛奶(5%)封闭2 h后，加入一抗，在25 ℃下孵育1 h，缓慢摇动。使用TBST洗3次，加入合适稀释度的辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育1 h后，TBST洗3次。采用ECL化学发光底物显色，UVP化学发光成像系统获取图像信息，Image J软件分析条带光密度值，目的蛋白与其对应的内参比较后，再于正常组比较得出相对表达量。

2.2 动物实验

2.2.1 斑马鱼AS模型建立及血管中斑块检测

本研究采用高脂饲料喂食斑马鱼建立斑马鱼AS模型[12]，即对受精后5天(dpf)的斑马鱼幼鱼喂食含4%胆固醇的高脂饲料10天。为了能够观察到血管中斑块形成情况，本研究采用转基因型(flil:EGFP)斑马鱼(血管带有绿色荧光标记)建造AS模型，并在高脂饲料中添加一些橙色荧光标记的胆固醇(比例为10 μg/g)。将5 dpf的flil:EGFP斑马鱼幼鱼分成5组：正常组、AS模型组、0.1 mg/L迷迭香酸治疗组、1 mg/L迷迭香酸治疗组和10 mg/L迷迭香酸治疗组。在正常组中，向幼鱼喂食正常基础饲料13天即可。在AS模型组中，先喂食3天正常基础饲料，在喂食10天含4%胆固醇的高脂饲料(带有橙色荧光标记的)10天。在3个不同剂量的迷迭香酸治疗组中，先喂食3天正常基础饲料，在喂食10天含4%胆固醇的高脂饲料(带有橙色荧光标记的)10天，并在喂食高脂饲料的同时给予不用剂量(0.1、1和10 mg/L)的迷迭香酸治疗。喂食高脂饲料10天后，禁食24 h，在荧光显微镜下可以清楚看到绿色荧光血管中有大量橙色荧光标记的脂质蓄积。已经有研究证明了[13]，这些血管中蓄积的脂质与人AS的早期斑块成分是相似的。故可通过此模型来观察AS斑块的形成情况。

2.2.2 检测斑马鱼的炎症反应

采用转基因型(mpx:EGFP)斑马鱼(中性粒细胞带有绿色荧光标记)建造AS模型。斑马鱼的分组与处理与方法“2.6”中的一致，但是所喂食的高脂饲料不含有橙色荧光标记的胆固醇。喂食高脂饲料10天后，禁食24 h，在荧光显微镜下，可通过观察斑马鱼血管中绿色颗粒状的中性粒细胞数量来反应炎症程度。

2.2.3 检测斑马鱼的氧化应激

采用野生型AB品系斑马鱼建造AS模型。斑马鱼的分组与处理与方法“2.6”中的一致，但是所喂食的高脂饲料不含有橙色荧光标记的胆固醇。喂食高脂饲料10天后，禁食24 h后，使用DCFH-DA活性氧ROS荧光探针，观察各组斑马鱼ROS活性。

2.2.4 检测迷迭香酸的降脂作用

采用野生型AB品系斑马鱼建造AS模型。斑马鱼的分组与处理与方法“2.6”中的一致，但是所喂食的高脂饲料不含有橙色荧光标记的胆固醇。喂食高脂饲料10天后，禁食24 h后，使用尼罗红染色，观察迷迭香酸对AS斑马鱼血脂水平的影响。

2.3 数据统计

3 结果

3.1 迷迭香酸改善低剪切力诱导的血管内皮细胞功能紊乱

结果如图1所示，低剪切力显著升高EA.hy926细胞中ROS活性，并降低NO的活性。1和10 mg/L迷迭香酸能有效改善低剪切力诱导的ROS活性升高和NO活性降低。0.1 mg/L迷迭香酸对低剪切力诱导的ROS活性升高和NO活性降低并没有显著影响。

图1 迷迭香酸降低ROS活性，并升高NO活性(n=3)

3.2 迷迭香酸改善低剪切力诱导的炎症反应

通过q-PCR和Western blotting检测一些血管黏附分子(ICAM-1和VCAM-1)的基因和蛋白表达来反应EA.hy926细胞的炎症情况。q-PCR检测结果如表2所示，低剪切力显著升高EA.hy926细胞中ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达。1和10 mg/L迷迭香酸能显著降低低剪切力诱导的ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达升高。0.1 mg/L迷迭香酸对ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达并没有显著影响。western blotting检测如图2所示，低剪切力显著增加ICAM-1的蛋白表达，1和10 mg/L迷迭香酸能显著降低低剪切力诱导的ICAM-1的蛋白表达升高，但是0.1 mg/L迷迭香酸对ICAM-1的蛋白表达没有显著影响。低剪切力显著增加VCAM-1的蛋白表达，10 mg/L迷迭香酸能显著降低低剪切力诱导的VCAM-1的蛋白表达升高，但是0.1和1 mg/L迷迭香酸对VCAM-1的蛋白表达没有显著影响。

表2 迷迭香酸降低低剪切力诱导的ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达升高(n=3)

注：与0 min LSS+ 0 mg/L RosA组比较，##P<0.01；与30 min LSS + 0 mg/LRosA组比较，**P<0.01。

Note:Compared with 0 min LSS + 0 mg/L RosA,##P< 0.01;Compared with 30 min LSS + 0 mg/L RosA,**P< 0.01.

图2 迷迭香酸降低低剪切力诱导的ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达升高(n=3)

3.3 迷迭香酸减轻AS斑马鱼血管中斑块的形成

通过观察斑马鱼血管中的脂质蓄积来反应斑块的形成情况。结果如图3所示，正常组斑马鱼血管中并未出现斑块。与正常组比较，AS模型组中出现大量的橙色脂质斑块。与AS模型组比较，1和10 mg/L迷迭香酸治疗均能有效减轻血管中的斑块形成。0.1 mg/L迷迭香酸治疗并不能有效减轻斑块的形成。

图3 迷迭香酸减轻AS斑马鱼血管中斑块的形成(n=6)

3.4 迷迭香酸改善AS斑马鱼的炎症反应

通过观察斑马鱼的中性粒细胞来反应炎症情况。结果如图4所示，与正常组比较，AS模型组斑马鱼出现大量的中性粒细胞。与AS模型组比较，1和10 mg/L迷迭香酸治疗均能有效降低中性粒细胞数目。0.1 mg/L迷迭香酸对AS斑马鱼的中性粒细胞数量并没有显著影响。

3.5 迷迭香酸改善AS斑马鱼的氧化应激

通过检测斑马鱼ROS水平来反应斑马鱼的氧化应激状态。结果如图5所示，与正常组比较，AS模型组斑马鱼的ROS水平显著升高。与AS模型组比较，1和10 mg/L迷迭香酸治疗均能有效降低ROS水平。0.1 mg/L迷迭香酸对AS斑马鱼的氧化应激并没有显著影响。

图4 迷迭香酸降低AS斑马鱼的中性粒细胞数量(n=6)

图5 迷迭香酸降低AS斑马鱼的ROS水平(n=6)

3.6 迷迭香酸降低AS斑马鱼的血脂水平

通过尼罗红染色观察斑马鱼的血脂水平。结果如图6所示，与正常组比较，AS模型组斑马鱼的血脂水平显著升高。与AS模型组比较，1和10 mg/L迷迭香酸治疗均能有效降低血脂水平。0.1 mg/L迷迭香酸对AS斑马鱼的血脂水平并没有显著影响。

图6 迷迭香酸降低AS斑马鱼的血脂水平(n=6)

4 讨论与结论

斑马鱼是一种常见的热带鱼，由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视[14]。斑马鱼已经被用于复制多种人类疾病模型，如肿瘤、非酒精性脂肪肝、心肌缺血再灌注损伤等模型[15-17]。同样，斑马鱼也被用于建造AS模型，目前研究发现，通过高脂喂食斑马鱼幼鱼，可以促进脂质在斑马鱼血管中发生蓄积，并且研究也证明了这些蓄积的脂质与人类早期AS斑块的成分是相似[12,13]。在本研究中，我们确实发现高脂喂食可以诱导大量的脂质蓄积在斑马鱼的血管中。这也进一步说明了通过高脂喂食建立斑马鱼AS模型是可行的。并且迷迭香酸可以显著改善高脂喂食诱导的血管中脂质蓄积。这些结果说明，迷迭香酸可能具有治疗AS作用。

研究发现，斑块好发于血管弯曲内侧或血管分叉外侧，这说明流体力学在AS的发生中也起着重要的作用[18]。随着研究的深入，研究者们发现剪切力在AS的发生中起着重要的作用[19]。剪切力是指血流与血管内皮间的摩擦所用于血管壁单位面积的力，主要分为高剪切力、低剪切力和湍流剪切力。研究发现，低剪切力会诱导血管内皮细胞功能紊乱，促进AS的发生。最近也有研究通过对斑马鱼进行剪切力检测，并发现斑马鱼尾部静脉处为低剪切力(见图7)，证明了斑马鱼也可以用于研究低剪切力诱导AS[20]。在本研究中，我们确实发现，脂质蓄积主要发生在斑马鱼的尾部静脉中，并且有研究已经证实了这些蓄积在血管中的脂质与人AS斑块发生位置是相似的[13]。这一结果也进一步说明斑马鱼AS模型是可以用于研究低剪切力诱导的AS。为了能进一步研究迷迭香酸抗AS作用与低剪切力之间的关系，我们采用平行板流动腔体外模拟低剪切力诱导血管内皮细胞功能紊乱模型。结果表明，迷迭香酸可以有效改善低剪切力诱导的血管内皮细胞功能紊乱，主要表现为降低低剪切力诱导的ROS升高、NO活性降低和血管黏附分子(ICAM-1和VCAM-1)mRNA的升高。这些结果说明，迷迭香酸的抗AS作用可能与其改善低剪切力诱导的内皮细胞功能紊乱作用有关。

中性粒细胞在AS的发生中起着重要的作用，一些血管黏附分子(ICAMs)的异常表达会造成中性粒细胞募集在血管内膜上，造成炎症的发生，促进AS的发生[21]。在本研究中，我们发现AS斑马鱼低剪切力血管中聚集了大量的中性粒细胞，并且细胞实验也发现了，低剪切力能诱导黏附分子高表达。这写、些结果说明，低剪切力可能通过增加黏附分子的表达，诱导中性粒细胞向低剪切力血管处募集，诱发血管炎症，促进AS的发生。而迷迭香酸的治疗可以显著改善这些低剪切力诱导的不良现象。这些结果也进一步说明，迷迭香酸能改善低剪切力诱导的炎症反应。

引发AS的机制有很多，如高脂血症、氧化应激和炎症反应[22,23]。在本研究中，我们确实发现高脂喂食可以显著升高斑马鱼的血脂水平，同时也诱发了氧化应激和炎症反应。迷迭香酸治疗可以显著降低血脂水平，并改善氧化应激和炎症反应。这些结果说明，迷迭香酸的抗AS作用可能与其降血脂、抗氧化和抗炎作用相关。