木芙蓉叶黄酮成分抗氧化及月周期规律研究

程 鹏，邬 洁，何先元,*，李昕燃，杨 鸿，黄英如

1重庆医科大学实验管理中心；2重庆医科大学中医药学院，重庆 401331；3云南中医药大学，昆明650504

木芙蓉叶是2015年版药典新增收载的药物，为锦葵科植物木芙蓉HibiscusmutabilisL.的干燥叶[1]。夏、秋二季采收，干燥，防虫、低温储藏。味辛，性平；归肺、肝经。具有凉血，解毒，消肿，止痛的功效。临床用于治疗痈疽焮肿，缠身蛇丹，烫伤，目赤肿痛，跌打损伤等病症。含量照高效液相色谱法测定，按干燥品计算，含无水芦丁(C27H30O16)不得少于0.070%。大多数黄酮类化合物均有较强的抗氧化自由基的作用，中药的一些药理活性也往往与其抗氧化自由基相关。木芙蓉叶中含有芦丁等多种黄酮类化合物[2-5]，本实验以芦丁为主要指标，测定一年内不同月份采收木芙蓉叶的总黄酮含量变化规律，并检测木芙蓉叶总黄酮体外抗氧化活性，采用超高效液相色谱法测定一年内不同月份采收的木芙蓉叶4种黄酮成分含量变化规律，分析黄酮成分与抗氧化活性之间的相关性，以探讨木芙蓉叶黄酮组分-成分-效应之间联系，为评价木芙蓉叶药材质量和进一步开发利用木芙蓉叶提供理论依据。

1 材料与试剂

1.1 仪器

紫外-可见分光光度计(UV-1200型，上海美普达仪器有限公司)、超声清洗仪(批号：15C4649，宁波新芝生物科技股份有限公司)、电热恒温水浴锅(批号：O803141，上海跃进器械医疗有限公司)、TD5A-WS台式低速离心机(批号：5110080098，长沙湘离心机仪器有限公司)、PH计(编号17103029，成都世纪方舟科技有限公司)、电子天平(型号：FA2004，上海舜宇恒平仪器有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱(型号：DGG-9240B，上海森信实验仪器有限公司)、分子生物型超纯水机(型号：STS18-0321-012，重庆市安特生环保设备有限公司)、UFLC超快速高效液相色谱仪(岛津)、色谱柱C18色谱柱(批号：V3250001，上海安普公司)、移液枪(型号：YE4A178905)。

1.2 试剂

芦丁(C27H30O16，HPLC≧98%，批号：R106912)、金丝桃苷(C21H20O12，HPLC≧98%，批号：18111901)、槲皮苷(C21H20O11，HPLC≧98%，批号：19031304)、PTIO(C13H17N2O2，HPLC≧98%，P838429)、DPPH(C18H12N5O6，HPLC≧98%，D141336)、抗坏血酸(C6H8O6，HPLC≧98%，A103537)、ABTS(C18H24N6O6S4，HPLC≧98%，批号：A109612)，以上标准品均购自重庆奥怡生物技术有限公司。槲皮素(C15H10O7，HPLC≧98%，批号19032803)，成都普菲德生物技术有限公司，硫酸、磷酸钠、钼酸铵、过硫酸钾、无水乙醇、甲醇、乙腈、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾均为分析纯。

1.3 材料

木芙蓉叶每月15日采自重庆医科大学植物园，阴干备用，经重庆医科大学费曜副教授鉴定为锦葵科植物木芙蓉HibiscusmutabilisLinn的叶。

2 实验方法

2.1 木芙蓉叶总黄酮测定

2.1.1 样品总黄酮提取

参考以最佳提取工艺[2]，称取木芙蓉粗粉约3 g，置于250 mL的锥形瓶中，加入99 mL的46%乙醇溶液，在60 ℃，功率100 W条件下超声提取2次每次34 min。滤过，合并滤液，低温保存，备用。

2.1.2 芦丁标准曲线标准曲线

精密称取芦丁5.40 mg，用50%的乙醇溶解后，定容于50 mL容量瓶中，配制为质量浓度为1.08 mg/mL的芦丁标准品溶液。分别取该溶液0、1、2、3、4、5 mL，置于10 mL容量瓶。各组依次加入0.5% NaNO20.3 mL，混匀，放置6 min；再加入10% AlCl30.3 mL，摇匀，放置6 min；最后加入1 mol/L NaOH 4 mL，并以50%乙醇定容至刻度线，摇匀，放置15 min。用紫外-可见分光光度计测定吸光度(检测波长510 nm)。y=0.086 1x+0.001 4。R2=0.999 8(x为吸光度，y为浓度单位mg/mL)。

不同月份采收木芙蓉叶的总黄酮提取液按上述方法，分别测定其总黄酮浓度，并记录C，然后将总黄酮提取液配制为300 μg/mL的母液，备用。

2.2 抗氧化活性测定

2.2.1 维生素C的标准液配置

精密称取Vc标准品16.4 mg，用50%的乙醇溶液溶解并定容于50 mL容量瓶中，作为母液备用。

2.2.2 抗氧化性活性实验

依据酸性介质中，还原剂存在的条件下，正磷酸根离子与钼酸铵形成蓝色络合物，在700 nm有较强的紫外吸收，且吸光度值大小与还原能力即抗氧化的能力成正比的原理。

分别精密移取各样品母液和Vc标准品溶液1 mL于试管中，(依照设置的浓度梯度20、40、60、80、100、150、200、250 μg/mL加样)，以50%乙醇溶液作空白。依次加入0.6 mol/L硫酸溶液1mL，28 mmol/L磷酸钠溶液1.5 mL，4 mmol/L钼酸铵溶液1.5 mL，蒸馏水1 mL，摇匀后，于95 ℃水浴90 min，取出极速冷却后，用紫外-可见分光光度计在波长695 nm处测定吸光度并记录A。每组实验重复3次，取平均值。采用同法制备相同浓度梯度的 Vc 做对比试验，下同。

2.2.3 DPPH实验

DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，在自由基清除剂存在的条件下DPPH中氮原子上的单电子被捕获，溶液颜色变浅。在517 nm处测定吸光度，计算样品自由基清除率。

分别精密移取各月份样品母液和Vc标准品母液各2 mL后(依照设置的浓度梯度4、8、20、40、60、100、150 μg/mL加样)，再加入2 mL DPPH作为实验组，每组重复实验3次。避光放置30 min，在紫外517 nm波长条件下测吸光度A，用2.0 mL的50%乙醇溶液+2.0 mL DPPH作为空白对照A1；2.0 mL无水乙醇+2.0 mL样品溶液作样品对照A0。

DPPH自由基清除率=(1-(A-A0)/A1)× 100%

2.2.4 ABTS实验

ABTS在氧化剂存在时被氧化成绿色，抗氧化物存在时则被抑制，在414或734 nm波长处测定吸光度，可计算总抗氧化能力。吸光度大小与还原能力即抗氧化的能力成反比。

ABTS粉末用蒸馏水溶解成浓度为7 mmol/L的试液，再与浓度为140 mmol/L的过硫酸钾按比例混合，室温，避光静置过夜，使用时用无水乙醇稀释成工作液(要求在734波长下吸光度在0.68～0.72范围，实际稀释了约100倍)。

参考文献方法，分别精密移取各月份样品母液和Vc标准品溶液0.4 mL后(依照设置的浓度梯度4、8、10、20、40、80、100、150 μg/mL加样)，再加入3.6 mL ABTS工作液作为实验组，每组重复实验三次。加入后振摇使混合均匀，静置6 min，在波长734 nm处测吸光度，记为A。另外设置样品对照组以0.4 mL样品溶液+3.6 mL无水乙醇(2组)，吸光度记为A0；空白对照3.6 mL ABTS工作液+0.4 mL 50%的乙醇溶液(3组)吸光度记为A1，其余操作与实验组同。

ABTS自由基清除率=(1-(A-A0)/A1)× 100%

2.2.5 PTIO实验

PTIO在甲醇和水溶液中是一种稳定的自由基，在自由基清除剂存在的条件下PTIO上的单电子被捕获，溶液颜色变浅。在557 nm处测定吸光度，可以计算样品自由基清除率。

分别精密移取各月份样品母液和VC标准品溶液1 mL后(依照设置的浓度梯度10、40、60、100、200、250、300 μg/mL加样)，再加入2 mL PTIO作为实验组，每组重复实验3次。37 ℃水浴并避光反应3 h，在557 nm测吸光度A。用1.0 mL的50%乙醇溶液+2.0 mL DPPH作为空白对照A1；2.0 mL无水乙醇+1.0 mL样品溶液作样品对照A0。

PTIO自由基清除率=(1-(A-A0)/A1)×100%

2.3 UFLC法测定木芙蓉叶黄酮成分

2.3.1 混合标准品和样品的配制

精密移取2.1.1项下各月份木芙蓉叶总黄酮母液300 μg/mL作为供试品溶液。

综合前人研究结果，选取极性分布均匀的芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素等4个成分作为标准品，分别精密称取芦丁8.18 mg、金丝桃苷7.26 mg、槲皮苷7.15 mg、槲皮素8.09 mg，50%乙醇为溶剂定容于50 mL容量瓶中，配制浓度为163.6、145.2、143、155.6 μg/mL。

2.3.2 标准曲线绘制

以50%乙醇溶液为空白对照，“2.3.1”项下的混合标准品溶液以0.1%的冰醋酸溶液-乙腈为流动相，C18柱为固定相，流速1 mL/min，柱温25 ℃，检测波长370 nm，按照优化的浓度梯度(表1)。进样0、1、2、4、8、15、20 μL，每个体积重复进样2次。记录各标准品浓度对应的平均峰面积值，计算含量。

表1 LC时间程序

2.3.3 木芙蓉叶总黄酮样品成分分析

不同月份采收的供试品溶液经微孔滤膜过滤后，进样20 μL，参照2.3.2项下的分析方法进行成分分离，每个供试品溶液重复进样一次。记录不同月份采收供试品中标准品对应的峰面积值，通过标准曲线计算各成分的含量。

3 结果与分析

3.1 4～11月木芙蓉叶总黄酮含量测定结果

分光光度法测定4～11月木芙蓉叶总黄酮含量变化趋势如图1，8月份总黄酮含量最高，4月份次之，11月份最低。总体趋势高-低-高-低-高-低。11月份叶片接近枯黄脱落，总黄酮含量下降速度最快。

图1 4～11月木芙蓉叶总黄酮含量变化趋势

3.2 木芙蓉叶总黄酮抗氧化结果

3.2.1 木芙蓉叶总黄酮抗氧化性活性结果

根据抗氧化力测定的基本原理，从图2可以看出，每个月木芙蓉叶总黄酮抗氧化性活性，随着浓度的增加而增加，但与对照品Vc相比，提高幅度不大，特别是在高浓度条件下，更是明显。

图2 不同月份不同浓度木芙蓉叶总黄酮抗氧化性变化趋势

图3 4～11月木芙蓉叶总黄酮抗氧化性变化趋势

从图3来看，总黄酮抗氧化活性4月份最低，5和6月份上升，7、8月份下降，9月份升高，10、11月份下降，总体呈现出双“S”曲线，与植物生长大周期基本一致，可以推测，木芙蓉叶总黄酮抗氧化活性物质与生长代谢物质变化相关。

3.2.2 木芙蓉叶总黄酮对DPPH自由基的清除能力

以8月份木芙蓉叶总黄酮与对照品Vc对比研究，木芙蓉叶总黄酮对DPPH自由基的清除能力，从图4可以看出，其清除能力随浓度增高而增强，浓度60 μg/mL以后增速减缓。以浓度100 μg/mL，测定4～11月木芙蓉叶总黄酮对DPPH自由基的清除能力，结果如图5所示，4月份和10月份较强，7月份和11月份较弱，呈现出一个弱“S”曲线。

图4 木芙蓉叶总黄酮对DPPH自由基的清除能力

图5 4～11月木芙蓉叶总黄酮对DPPH自由基的清除能力

3.2.3 木芙蓉叶总黄酮对ABTS自由基的清除能力

从图6可以看出，木芙蓉叶总黄酮对ABTS自由基的清除能力随浓度增大而增强，浓度在80 μg/mL以后增长缓慢，几乎接近对照品Vc的强度了。选取浓度150 μg/mL，测定4～11月木芙蓉叶总黄酮对ABTS自由基的清除能力，结果如图7，4月和9月较弱，6月和11月较强，也呈现出一个“S”曲线。

图6 木芙蓉叶总黄酮对ABTS自由基的清除能力

图7 4～11月木芙蓉叶总黄酮对ABTS自由基的清除能力

图8 木芙蓉叶总黄酮对PTIO自由基的清除能力

图9 4～11月木芙蓉叶总黄酮对PTIO自由基的清除能力

3.2.4 木芙蓉叶总黄酮对PTIO自由基的清除能力

从图8可以看出，木芙蓉叶总黄酮对ABTS自由基的清除能力随浓度增大而缓慢增强。以浓度为300 μg/mL，测定4～11月对ABTS自由基的清除能力，结果如图9，4、6、8、10月较强，5、7、9、11月较弱，基本呈现的是强-弱交替变化的趋势。

3.3 UFLC法测定木芙蓉叶4种黄酮成分含量

3.3.1 标准曲线绘制

根据2.3.2项下记录的各标准品浓度对应的平均峰面积值结果，以峰面积作为横坐标x，标准品浓度作为纵坐标y，制作标准曲线并计算峰面积和标准品含量的相关性，结果如表2。

表2 4种黄酮成分对照品标准曲线

3.3.2 UFLC法测定4种黄酮类物质成分4～11月变化趋势

UFLC法测定木芙蓉叶4种黄酮物质，从图10可以看到，总体来看，金丝桃苷含量最高，金丝桃苷含量在木芙蓉叶生长周期内呈现出高-低-高-低变化趋势，其中7月和11月含量急剧下降。芦丁含量变化总体比较平缓，11月含量下降较快。槲皮苷含量5月最高，11月最低，总体呈现出“S”形变化趋势。槲皮素含量4～5月增长平缓，以后下降，9月增高，11月最高，呈现出与其他3个组分物质不一致的变化趋势。

图10 4种黄酮成分含量4～11月变化趋势

3.3.3 总黄酮及4种黄酮类物质与抗氧化性相关比较结果

将总黄酮及4种黄酮类物质4～11月含量变化趋势与不同检测方法的抗氧化性活性进行相关性分析，结果见表3。总黄酮、芦丁和金丝桃苷含量与总抗氧化性呈负相关。总黄酮、芦丁、金丝桃苷和槲皮苷含量与DPPH自由基清除率呈正相关，槲皮素与DPPH自由基清除率呈负相关。金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素与ABTS自由基清除率呈正相关，芦丁与ABTS自由基清除率呈负相关。芦丁、金丝桃苷和槲皮苷与PTIO自由基清除率呈正相关，槲皮素与PTIO自由基清除率呈负相关。总体来看，总黄酮和芦丁与4种检测抗氧化活性趋势基本一致，槲皮苷与4种检测抗氧化活性均呈现正相关，说明木芙蓉叶中槲皮苷组分抗氧化作用明显。因此，在研究黄酮类物质抗氧化性活性时，不能以一种检测方法来确定其强弱，而是要综合考虑。

表3 黄酮类物质与抗氧化性相关系数

4 讨论与结论

木芙蓉叶总黄酮含量8月份最高，11月份最低，黄酮成分芦丁含量10月份最高，11月份最低，金丝桃苷含量6月份最高，11月份最低、槲皮苷含量5月份最高，11月份最低、槲皮素含量4月份最高，8月份最低。总抗氧化活性9月份最强，DPPH自由基清除率10月份最强，ABTS自由基的清除能力6月份最强，PTIO自由基的清除能力10月份最强。芦丁每个月含量变化起伏不大，结合抗氧化活性强弱，木芙蓉叶中芦丁成分可以作为药效评价和木芙蓉叶药材质量的指标。同时本研究进一步说明现阶段中药药效研究主要成分的合理性，中药材采收期影响成分含量及其药效，中药的药效是多组分综合效应协同作用的结果，为中药药效研究需要提高成分分离技术，多成分检测技术提供了理论依据。