产蛋主要基因对籽鹅产蛋性能的影响研究

李 鹏，董嫁诗，刘鼎鑫

黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319

北方寒区多年来饲养的地方良种鹅－籽鹅，产于黑龙江绥化和松花江地区，是世界上产蛋量最多的鹅种之一，一般年产蛋可达14～20 kg[1]。然而，随着鹅产业的迅速发展，鹅的需求量逐年增加，但由于鹅繁殖性能较低，限制了鹅产业的发展[2]。据专家预测，目前全国养鹅约6亿多只，鹅肉产量70万吨，约为牛羊肉产量的40%；市场缺口在3亿只左右。利用分子生物学技术提高禽类繁殖性能的研究发展很快，在鸡的研究方面尤为突出，国内外均取得了较多的科研成果[3]。本研究针对影响籽鹅产蛋性能的主要基因即促卵泡素（FSH）、催乳素（PRL）、抑制素（INH）开展研究，以提高籽鹅的繁殖性能，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

选择本地健康成年雌性籽鹅2只，取籽鹅卵泡及脑垂体。

1.1.2 所需试剂

pMD18T载体（购自宝生物工程（大连）有限公司）；pcDNA3.0、pET-32a载体（由本实验室保存）；RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒、PCR试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司）；限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ（购自宝生物工程（大连）有限公司）；T4DNA 连接酶（购自北京鼎国生物科技有限公司）；其余试剂均为分析纯试剂。

1.1.3 主要仪器

Pico-21型台式离心机（美国Thermo Fisher生产）；DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂生产）；凝胶成像系统（美国UVP生产）；T100TM型PCR仪（美国BIO-RAD生产）；LDZX-50KBS型高压灭菌器（艾科仪器生产）；DRP-9272型培养箱（上海培因试验仪器有限公司生产）；超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司生产）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取、反转录、PCR方法

提取籽鹅卵泡及脑垂体的总RNA，使用反转录试剂盒将RNA反转录获得cDNA，通过RT-PCR扩增促卵泡素（FSH）、催乳素（PRL）、抑制素（INH）基因。

1.2.2 重组真核、原核表达载体构建

将通过PCR获得的FSH、PRL、INH基因与pMD18T载体连接，转化至DH5α感受态中，扩增培养后使用质粒提取试剂盒提取重组质粒，使用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ对重组质粒进行酶切鉴定，并将重组质粒进行测序，将测序结果进行Blast比对。将酶切后的FSH、PRL、INH基因进行回收，将FSH基因与与pcDNA3.0载体相连接，PRL、INH基因与pET-32a载体连接，将重组pET-32a-PRL及pET-32a-INH载体转化至BL21感受态细胞中，将重组pcDNA3.0-FSH转化至DH5α感受态中，扩增培养后提取重组质粒，双酶切鉴定后进行再次测序，将测序正确的重组质粒放置于-80 ℃冰箱中留用。

1.2.3 PRL、INH蛋白表达及纯化

对包含重组pET-32a-PRL及pET-32a-INH载体的BL21感受态细胞进行培养，加入IPTG诱导重组载体表达，用超声波裂解仪破碎细菌进行SDS-PAGE电泳，检测PRL、INH蛋白表达情况，然后将包含重组pET-32a-PRL及pET-32a-INH载体的BL21感受态细胞进行扩大化培养，超声波裂解仪破碎细菌后收集蛋白，使用Ni层析柱进行蛋白纯化，获得纯化蛋白后放置于-80 ℃冰箱中留用。

将包含重组pcDNA3.0-FSH载体的DH5α感受态细胞进行扩大化培养，使用质粒大提试剂盒提取重组质粒，放置于-80 ℃冰箱中留用。

1.2.4 免疫籽鹅

选取成年产蛋巅峰期籽鹅及产蛋初期的籽鹅进行免疫，将成功构建的重组真核表达载体pcDNA3.0-FSH、纯化的PRL、INH蛋白单独及联合免疫籽鹅，蛋白免疫剂量每次为100 μg，重组质粒免疫剂量每次为10 μg，每组免疫30只籽鹅。

隔2周免疫1次，共免疫3次。

1.2.5 产蛋量观察

观察并统计免疫籽鹅及正常籽鹅的年产蛋数量、产蛋周期。

1.2.6 统计学处理

采用SPSS17.0及Excel对数据进行统计分析，计量资料以均数加减标准差（ ± ）表示，组间两两比较采用t检验，多组间比较采用LSD–t检验，当p＜0.05时，表示差异显著，具有统计学意义。

2 结果

2.1 产蛋量情况

统计4组籽鹅接种免疫后1年内产蛋量情况，结果显示，4组籽鹅接种免疫后1年内的产蛋量均较正常籽鹅有所增加，其中联合免疫的产蛋巅峰期籽鹅、产蛋初期籽鹅及免疫INH的产蛋初期籽鹅的年产蛋量与正常籽鹅相比较，差异具有统计学意义（p＜0.05），详细结果见表1。

表1 籽鹅产蛋量比较情况（ ）

表1 籽鹅产蛋量比较情况（ ）

PRL 81.05±2.48 82.04±2.69 INH 81.72±2.65 82.63±3.07*联合免疫 82.91±3.18* 83.87±3.44*项目 产蛋巅峰期籽鹅 产蛋初期籽鹅 正常籽鹅FSH 80.47±2.23 81.61±2.64 79.62±2.69

2.2 产蛋周期情况

统计4组籽鹅接种免疫后1年内产蛋周期情况，结果显示，4组籽鹅接种免疫后1年内的产蛋周期均较正常籽鹅有所增加，其中联合免疫的产蛋巅峰期籽鹅、产蛋初期籽鹅及免疫INH的产蛋初期籽鹅的产蛋周期与正常籽鹅相比较，差异具有统计学意义（p＜0.05），详细结果见表2。

表2 各组籽鹅产蛋周期情况（x ±s ）

3 讨论

促卵泡素（FSH）是动物脑垂体前叶促性腺激素细胞（嗜碱性细胞）分泌的一种糖蛋白激素，对于雄性动物的精子发生，雌性动物卵泡的生长发育、成熟、排卵，乃至类固醇激素的合成都是极为重要的调节激素[4]。在生产实践中主要用于动物的诱导发情和超数排卵，以及治疗垂体和性腺机能障碍。催乳素（Prolactin，PRL）是垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种蛋白激素。对于哺乳动物，PRL能直接作用于卵巢颗粒细胞，抑制促卵泡激素(FSH)诱导的颗粒细胞芳香化酶活性，使雌二醇（E2）合成减少，并抑制排卵；禽类就巢期间，血液PRL含量明显升高，黄体生成素（LH）和卵巢类固醇水平下降，卵巢萎缩，排卵停止。因此，PRL在卵泡发育中具有重要作用[5]。抑制素（inhibin, INH）是一种主要由雄性睾丸支持细胞（Sertoli2 like cells）和雌性卵巢颗粒细胞（granulosa cells）分泌的二聚体糖蛋白激素，目前家禽中只有鸡抑制素和活化素各亚基序列已被测定。研究发现家禽INH和ACT与哺乳动物的同源性较高，在进化上比较保守，尤其是鸡βA亚基C-端在进化上非常保守[6]。

本研究通过分子生物学手段，获得影响籽鹅产蛋性能的促卵泡素、催乳素和抑制素基因，并通过降低籽鹅体内催乳素和抑制素水平，延长籽鹅的产蛋时间和促进籽鹅FSH的分泌，提高籽鹅体内FSH水平，以提高籽鹅的产蛋性能。