基于秀丽隐杆线虫的真菌毒素毒性评价研究进展

郭亦晨，李珂，2，3，吴中琴，李宗军，2，3，*

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128；3.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南长沙410128）

真菌污染食品主要发生在粮食作物、油料作物以及发酵食品上。真菌污染食品主要的危害在于真菌产生次级代谢产物——真菌毒素，它是由具有产毒功能的产毒菌株分泌的一种细胞外毒素，主要产生于含有丰富碳水化合物的食品原料或动物饲料。能产生真菌毒素的真菌一般以霉菌为主，霉菌在自然界分布非常广泛，同时霉菌可以产生许多细小的霉菌孢子，这些霉菌孢子很容易传播进而污染到食品原料和动物饲料。真菌污染不仅可以造成腐败变质而且有可能造成人和动物中毒，有些真菌毒素造成的危害是不可逆，甚至还有未知的毒害作用[1]。现代毒理学研究通常是在模式生物上进行试验，得到数据和结果后经过一定的分析推及其至人体内的毒性作用。研究真菌毒素的模式生物中猪和大鼠最为常见，其次是肉鸡和小鼠，另外还有鱼类、马、火鸡和兔子，近些年出现果蝇和秀丽隐杆线虫等无脊椎动物[2]。评价真菌毒素的毒理学评价试验可归纳为：急性毒性试验、亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验、毒代动力学试验和致畸试验。运用传统模式生物评价真菌毒素存在代谢情况比较复杂、繁殖周期过长和饲养条件与经济成本较高等缺点。由此看出发展一种简单、高效和成本低廉的评价真菌毒素的模式生物迫在眉睫。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，以下简称线虫或C.elegans）作为模式生物始于20世纪60年代，英国科学家Sydney Brenner（Brenner S）发现了这种可以在土壤中自由生活的线虫[3]，70年代中期，John Edward Sulston（Sulston J E）构建了完整的线虫细胞谱系图[4]，并与Brenner S合作完成了线虫神经元的完整结构图[5]，90年代末他们完成了线虫的全基因测序，使线虫成为基因组被完整测序的第一个动物。线虫作为模式生物最初是应用于发育生物学和神经生物学领域，而今线虫已经发展成为研究发育、寿命和环境毒理学等方面重要的模式生物[6]。

1 秀丽隐杆线虫及真菌毒素简介

1.1 秀丽隐杆线虫

线虫是一种可以生活在土壤中、个体微小的、以细菌为食的生物。成年线虫呈蠕虫状，体长大概1.5 mm。线虫身体全体通透，其表面有角质层包裹。线虫有雄性与雌雄同体两种性别，其中雌雄同体占99.8%，雌雄同体线虫交配时尾部可由锥形变成扇形，一条雌雄同体线虫与雄性线虫交配可产生1 000多条后代，雌雄同体线虫能产生大概300枚受精卵[7]。

1.2 真菌毒素

常见的真菌毒素有黄曲霉毒素B1（aflatoxin，AFB1）、赭曲霉毒素A（ochratoxins A，OTA）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）、T-2毒素以及脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）等。这些真菌毒素对人和动物的危害包括致癌、致畸、致突变、生殖毒性、神经毒性和基因毒性等。鉴于真菌毒素的危害，我国制定了相关国家标准。几种重要的真菌毒素及其生物学作用和中毒状见表1[8]。

表1 重要的真菌毒素Table 1 Important mycotoxins

1.3 常用评价真菌毒素毒性的试验方法

常用于评价真菌毒素毒性的试验方法有急性毒性试验、亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验、慢性毒性试验、致畸试验和毒物动力学试验，归纳如表2。

表2 常用评价真菌毒素毒性的试验方法Table 2 Common methods of evaluating mycotoxin toxicity

2 应用线虫评价真菌毒素的常用指标

2.1 致死率

应用线虫研究真菌毒素常用的致死率指标参数包括 LC10、LC20和 LC50，分别代表 10%、20%和 50%受试模式生物死亡所需要的毒物浓度，其中以LC50最为常见。因致死率指标与其它指标存在相当大的关联性，所以致死率指标常与其它评价指标共同使用[14]。Yang等[15]使用不同浓度的AFB1、DON、伏马毒素B1（fumonisin B1，FB1）、T-2 毒素和 ZEA 处理野生型线虫（N2）24 h，并计算它们的LC50，其试验结果显示这5种真菌毒素的LC50为：T-2毒素（1mg/L）＞AFB1（20mg/L）＞ZEA（76 mg/L）＞FB1（235 mg/L）＞DON（657 mg/L）。致死率评价指标分析过程简易、效果显著、试验周期短，是利用线虫评价真菌毒素毒性的基本评价指标。

2.2 个体发育与运动行为指标

个体发育指标通常包括体长、体宽和畸形指标，体长指标是在毒理学评价中最先使用的指标[16]，常结合体宽应用。研究中，一般将L4期的线虫暴露一段时间，再通过Image-ProExpress software进行后续的分析[17-21]。Yang等[15]使用 L2 时期的野生型线虫（N2）进行真菌毒素对线虫个体发育影响的研究，线虫染毒72 h，每24 h进行比较观察，该研究表明受试线虫在5种真菌毒素的作用下，线虫的发育都表现出一定的剂量效应关系，随着真菌毒素浓度的增加，其对线虫形态发育的抑制也越明显，且依据EC50来看，所用真菌毒素对线虫发育影响的顺序为：AFB1＞T-2毒素＞ZEA＞FB1＞DON。周鸿媛等[22]研究表明在 0～48 h 内：AFB1随着暴露时间的增加，它对线虫体长增长的抑制作用越强；DON随着暴露时间的增加，它对线虫体长增长的抑制作用越弱；ZEA在此水平上则无明显区别。研究表明，各种真菌毒素除独自具有毒性外，它们的联合作用毒性危害更大，且在实际生活中造成的危害往往是多种真菌毒素联合作用的结果，其联合毒性主要表现在干扰蛋白质合成途径、破坏机体免疫、引起氧化应激和发育生殖毒性等[23-30]。周鸿媛等[22]用AFB1、DON、和ZEA 3种真菌毒素通过不同的组合分为不同的混合真菌毒素，且设置高、中和低3个剂量组，将其染毒L2时期的野生型线虫（N2）并测量体长，该研究表明AFB1+DON和AFB1+ZEA较单一暴露对线虫体长的抑制作用增强，表现出协同作用；DON+ZEA较单一暴露对线虫体长的抑制作用减弱，表现出拮抗；AFB1+DON+ZEA因浓度、时间等表现出不同的联合毒性类型。体长反映发育速率，体宽反映发育速率和生理状态，畸形暗示着高强度毒性的存在[31]。运动行为指标通常包括摆头频率、弯曲频率、运动速率和基本运动能力，运动行为指标是反映线虫神经系统的指标。运动行为指标具有操作简易、效果直观明了、周期短和成本低廉等优点。此外，咽泵运动、化学趋向性行为、消化能力和摄食也常用做分析线虫代谢与运动的指标[32]。

2.3 生殖能力与寿命指标

生殖能力指标包括世代时间、后代数目与子宫内卵数目。世代时间反映繁殖速度，后代数目反映繁殖能力，子宫内卵数目反映繁殖能力与生理功能。杨振东等[33]利用ZEN对野生型线虫（N2）进行亲代染毒，后代断毒。研究结果表明ZEN可对线虫产生可传递的发育与生殖能力缺陷，发育的缺陷尚可在子代中得到部分恢复，生殖缺陷并没有明显恢复。首次证实了ZEN对线虫发育与生殖能力点破坏是长期的，但这种亲本与自带之间的传递并不能简单的认为是遗传学上的“遗传”，需进一步研究。寿命指标一般包括最长寿命和半致死天数，秀丽隐杆线虫的寿命一般为25 d～30 d。有研究[34]发现 AFB1、DON、FB1、T-2 毒素和 ZEA 5 种真菌毒素均对线虫的寿命有较大的影响，表现为缩短线虫的最长寿命和半致死天数，依据线虫寿命缩短的速度，得到这5种真菌毒素对线虫寿命影响的排序为：T-2 毒素＞AFB1＞ZEA＞FB1＞DON。在该研究中：对照组线虫最大寿命和最长半致死天数分别为29、12 d；剂量组线虫最大寿命和最长半致死天数分别为13、6 d。由此可见真菌毒素对线虫寿命具有很强的抑制作用。

3 真菌毒素对线虫先天免疫信号通路的影响

线虫最先在土壤中被发现，它可在土壤中健康的生存，土壤中含有多种微生物、重金属和有毒化学物质等诸多不利因素[35]，所有动物都具有先进的先天免疫系统，以保护它们免受环境中的病原体的侵害[36]，线虫也不例外，过去几十年的研究表明这种防御机制的许多特征都是高等脊椎动物所共有的，线虫的先天免疫信号通路主要有：胰岛素／类胰岛素生长因子-1（insulin/Insulin-like growth factory-1，IIS）、细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）、转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）、丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）。这些通路在线虫抗病原甚至对抗外界不良刺激等方面都起到了积极的调控作用，但有关真菌毒素如何影响这些调控通路的研究很少，现将有关研究进展进行归纳。

3.1 IIS途径

Kenyon等[37]发现了能影响线虫寿命的IIS途径，此后IIS与线虫生长发育与寿命之间关系的试验越来越多。IIS对生物体生长、繁殖、新陈代谢乃至寿命是最重要生物调控通路之一，主要是通过DAF-16（其转录因子FOXO）同源物来实现的。Iser WB[38]首次提出了daf-2/IIS具有调控寿命的作用。有文献报道[39]，外界不良环境、氧化应激、饥饿和热刺激等都会对IIS通路产生抑制。还有研究者[40]提出IIS和FOXO还具有调节哺乳动物和线虫神经元的作用，他们首次鉴定了野生型线虫和IIS/FOXO突变型成年神经元转录组，IIS/FOXO神经元特异性靶点是IIS/daf-2突变体延长记忆所必需的，转录因子fkh-9在神经元中是daf-2突变体再生轴突所必需的，而在非神经元组织中daf-2是突变体延长寿命所必需的，他们的研究印证了Iser WB等的假设。Senchuk等[41]研究了3种线虫线粒体突变（clk-1，isp-1和nuo-6）来研究其长寿途径，发现受FOXO转录因子DAF-16调控的基因在所有3个突变体品系中均上调，并且这些线虫中存在的转录变化与IIS途径突变体daf-2明显相同。且DAF-16和多个DAF-16相互作用蛋白（MATH-33，IMB-2，CST-1/2，BAR-1）对于所有3个线虫线粒体突变体的维持正常寿命而言是必需的，这些突变体中DAF-16的活化是由ROS水平升高引起的，总的来说该研究揭示了3种线虫线粒体突变体中长寿的重叠遗传途径，此结果与之前的研究相结合，证明DAF-16是多种长寿途径中延长寿命的介质。

3.2 PCD途径

程序性细胞死亡，通常称为细胞凋亡，是多细胞生物生长发育过程中的重要过程，PCD的调控异常可能会导致机体疾病甚至癌症、自身免疫病和视网膜变性等[42-43]，其过程见图1。

图1 PCD过程Fig.1 Process of PCD

线虫是研究PCD的理想模式生物，因为线虫的1090个体细胞中131个会发生PCD。促凋亡和促生存蛋白可能存在于大多数细胞中[44]，ced-9抑制凋亡，ced-3和ced-4促进凋亡，还有吞噬基因ced-1、ced-2、ced-5、ced-6、ced-7、ced-8 和 ced-10，细胞死亡通常在促凋亡基因egl-1的转录控制水平上进行，当产生EGL-1 BH3蛋白时，它破坏抗凋亡ced-9 Bcl-2蛋白和ced-4 Apaf-1样蛋白之间的细胞保护作用，释放ced-4激活促凋亡胱天蛋白酶ced-3[45]，从而促进凋亡。Feng等[46]将同期化的线虫暴露在不同浓度的AFB1溶液中48 h，结果显示当AFB1浓度为10 mol/L较对照组无差异，然而当浓度增至30 mol/L和90 mol/L时，线虫体内凋亡基因会明显增加，分析后发现在10和30暴露组中，AFB1在xpa-1突变株中比N2品系中更容易诱导PCD。

3.3 TGF-β途径

TGF-β途径是进化上高度保守的免疫防御途径，在不良的环境条件下，线虫可停止发育进入dauer阶段，当环境条件改善时，它们会恢复发育并成年。调控线虫进入或退出dauer的3条关键的信号传导途径为TGF-β、IIS和鸟苷酸环化酶途径。该途径是参与调控细胞生长、分化和死亡的重要信号通路之一，虽然线虫中有 5种 TGF-β 相关配体（dbl-1、daf-7、unc-129、tig-2和tig-3），但只有两种完整的TGF-β信号传导通路被描述出来，分别是以daf-7和dbl-1为配体的Dauer pathway和Sma/Mad pathway。Dauer途径中daf-7通过I型受体daf-1和II型受体daf-4发出信号，Sma/Mab途径中dbl-1通过I型受体sma-6和II型受体daf-4发出信号。与人类一样，线虫通常在成年中期停止繁殖，线虫平均生殖跨度约为3.5 d，而dbl-1突变线虫的平均生殖跨度为7 d以上，dbl-1途径通常限制生殖跨度并促进及时停止生殖，从机理上讲，DBL-1途径通过调节种系和卵母细胞的质量来调节生殖衰老[47]。

3.4 MAPK途径

线虫秀早已被确定在先天免疫上具有保守的机制[48]。哺乳动物中3条高度保守的MAPK信号通路分别是：细胞因子抑制的抗炎药物结合蛋白激酶（cytokine-suppressive anti-inflammatory drug-binding protein kinase，p38 MAPK）、细胞外信号调节激酶（extra－cellular signal-regulated kinases，ERK MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK MAPK），这3条信号通路分别对应线虫中的PMK-1、MPK-1和KGB-1。Yang等[49]首次在DON的暴露下观察到胃上皮细胞（GES-1）中ROS快速增加，同时观察到线粒体DNA损伤、呼吸链受损、耗氧率降低、G2/M细胞周期停滞和细胞凋亡，经分析发现FOXO3a是关键转录因子，能调节与线粒体DNA损伤和细胞损伤相关的凋亡基因。此外，敲除FOXO3a可降低DON对GES-1的毒性，FOXO3a通过ROS/JNK/FOXO3a起着关键作用，作为DON诱导的细胞毒性的负调节剂。有研究[50]将处于 L2时期的线虫暴露于 125、250、500 μg/mL DON 中24 h，暴露于250、500 μg/mL DON会使线虫的存活率从100%降低至95%，而暴露于125 μg/mL DON中则没有影响。尽管对L2期线虫的生存能力影响很小，但暴露于DON会导致线虫繁殖力明显降低，DON暴露24 h可使后线虫产卵的数量分别减少36.7%，72.0%和92.7%。RT-qPCR分析表明DON显着上调了C17H12.8，K08D8.5和 F35E12.5的 mRNA 水平，而C17H12.8和K08D8.5正是编码 PMK-1的基因，RNAseq分析表明C17H12.8和K08D8.5基因表达分别增加了32.4倍和2倍。

4 总结与展望

真菌毒素作为危害粮食安全的重要因素，近些年越来越受到研究者的重视，据PubMed数据库数据，自2010年开始公开发表的关于真菌毒素的科研文章开始迅速增长。此前研究真菌毒素毒性的模式生物主要是猪、大鼠和鸡等动物，这些模式生物大都存在生命周期较长、生理结构复杂、饲养环境要求苛刻、不易实验室研究等困难。自上个世纪90年代开始，研究者把秀丽隐杆线虫应用到模式生物毒理学中来，利用线虫评价重金属、农药和化学材料等外源毒物的毒性。不计其数的研究证实秀丽隐杆线虫是理想的毒理学评价模式生物，其拥有全身透明、结构简单、生长繁殖速度快、周期短、与人类基因相似度高和可实验室培养等不可替代的优点。近几年，研究者才开始利用秀丽隐杆线虫研究真菌毒素，研究者利用发育、运动、致死率、生殖能力和寿命等指标证实了真菌毒素可显著抑制线虫的生长发育，减短寿命，减少后代数目和降低后代质量，其对线虫表现出“三致”毒性。这些是与之前利用其他模式生物研究真菌毒素的结果相符合的。虽然将线虫应用到环境评价和生态毒理学领域已有将近30年的历史，但近几年才初步构建以秀丽隐杆线虫为模式生物评价真菌毒素的体系。但在实验室条件下，线虫的应用仍存在以下问题：（1）液体试验中线虫数量难以控制；（2）运动行为指标在判断时具有很大的主观性；（3）各阶段线虫敏感性差异；（4）试验过程中各生物化学抑制剂对线虫本身的影响；（5）各信号通路间的交联作用不清晰。起步晚、发展快是基于线虫的真菌毒素研究的特点，对于真菌毒素如何影响线虫的IS、PCD、TGF-β和MAPK等通路的机制研究资料相当缺乏，这是研究者未来工作的焦点，在后续的研究中也应着重研究这些通路之间的相互作用。