金耳发酵液酸奶制作及品质分析研究

康林芝，吴居雄，唐惠妍，门戈阳，刘主

（1.韶关学院英东食品学院，广东韶关512005；2.韶关学院英东生物与农业学院，广东韶关512005）

金耳（Tremellaaurantialba），因其颜色金黄又称黄木耳，作为一种物美价廉的优质食用真菌，金耳除了含有珍贵的金耳多糖之外，还含有丰富的人体必需氨基酸、纤维素和微量元素等人体必需的营养物质，丰富的营养物质赋予了其滋阴养肺、止咳化痰、降血糖、调节免疫功能等多种功效，其食用、药用以及化妆品行业方面应用的商品价值极高[1-5]。但由于金耳子实体生长形成的周期和生长条件以及技术的限制，使得金耳相关产品的开发与研究工作在很大方面受到了限制。利用生物发酵技术获得菌丝体发酵液具有发酵周期很短、易于实现自动化、而且不受季节限制等优点[6-7]。所以本研究以金耳液体发酵得到的液态培养物和菌丝球为原料进行相关健康产品的开发，即解决了金耳子实体来源问题，同时也符合了现代人对食品营养健康的追求。

酸奶作为一种深受大众喜爱的食品，不仅口感好而且其营养价值丰富，可起到改善肠道菌群平衡、降血脂降胆固醇等功效，具有预防疾病的效果[8-10]。而近年来随着人民对食品营养性、安全性和享受性的要求越来越高，普通酸奶其口感和营养价值也逐渐满足不了消费者需求。因此本试验利用金耳液体发酵后获得的发酵产物与鲜牛奶混合，采用双歧杆菌发酵剂发酵研究出金耳发酵液酸奶的工艺并将其进行优化，开发出新型金耳发酵液酸奶。此酸奶不仅具有普通酸奶的营养价值，而且还含有金耳多糖、金耳所独具的微量元素等多种营养成分。这些营养成分也赋予了酸奶滋阴养肺、调节免疫功能等多种功效以及金耳香甜气息的特殊风味。开发出的具有独特风味、口感和营养价值提升的新型酸奶具有广阔的市场前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1）金耳一级菌种：昆明食用菌研究所；鲜牛乳：伊利集团；白砂糖（食品级）：市售；双歧杆菌酸奶发酵剂：川秀食品有限公司。

2）金耳发酵培养基

一级液体菌种培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）去琼脂培养基。二级液体发酵培养基：3%玉米粉、0.8%蛋白胨、0.2%MgSO4·7H2O、0.3%KH2PO4、0.002%VB1[9]。用柠檬酸和小苏打调pH值为5.0。以上均为食品级。

3）试验试剂

无水乙醇：广东光华科技股份有限公司；氢氧化钠、酚酞指示剂：西陇科学股份有限公司；蒸馏水；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA2004分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；BKQP-12高压蒸汽灭菌锅：山东博科科学仪器有限公司；0.1 mL～1mL移液枪：艾本德中国有限公司；SW-CJ-ICW超净工作台：苏州安泰空气技术公司；ZHP-250型恒温培养箱：上海三发科学有限公司；BCD-586WSF冰箱：山东青岛海尔集团；YX-01高压均质机：广州市钰翔轻工机械设备有限公司；HH-S28s水浴锅：金坛市大地自动化仪器厂；TGL20M-Ⅱ高速离心机：盐城市凯特实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金耳菌丝发酵液制备

1.3.1.1 液体种子制备

取250 mL的锥形瓶，装入100 mL PDA液体培养基，121℃灭菌20 min，放置冷却，在无菌操作台上接入3块～5块黄豆粒大小金耳母种，置于160 r/min摇床，25℃培养7 d，获得液体种子，放置冰箱备用[11]。

1.3.1.2 菌丝发酵培养

取250 mL锥形瓶，装入100 mL液体发酵培养基，121℃灭菌20 min，放置冷却，接入约7 mL的金耳液体种子，置于160 r/dmin摇床培养6 d，获得金耳菌丝发酵液。

1.3.1.3 菌丝发酵液制备

将1.3.1.2获得的金耳菌丝发酵液置于组织捣碎机中捣碎，得匀浆菌丝发酵液。

1.3.2 酸奶发酵剂制备

在无菌工作台内，按比例将2 g双歧杆菌酸奶发酵剂接种于100 mL鲜牛乳中，42℃培养8 h～10 h，作为后续试验组酸奶的发酵菌种，保存备用，4 d内使用。

1.3.3 金耳发酵液酸奶制备单因素试验

1.3.3.1 金耳菌丝发酵液添加量的优化

每瓶总体积100 mL，发酵液按0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%加入，鲜牛乳按相应比例加入，添加7%蔗糖，10%发酵剂（一代酸奶），于42℃发酵5 h，转入4℃冰箱后熟18 h，对成品进行感官品评以及酸度测定，确定最佳金耳菌丝发酵液添加量。

1.3.3.2 蔗糖添加量的优化

每瓶总体积100 mL，蔗糖按5%、6%、7%、8%、9%、10%加入，添加15%金耳发酵液，10%发酵剂（一代酸奶），于42℃发酵5 h，转入4℃冰箱后熟18 h，对成品进行感官品评以及酸度测定，确定最佳蔗糖添加量。

1.3.3.3 发酵剂接种量的优化

每瓶总体积100 mL，添加15%金耳发酵液，7%蔗糖，将酸奶发酵剂（一代酸奶）按1%、4%、7%、10%、13%、16%、19%的比例接种于灭菌的混合基料中，于42℃发酵5 h，转入4℃冰箱后熟18 h，对成品进行感官品评以及酸度测定，确定最佳发酵剂接种量。

1.3.3.4 发酵时间的优化

每瓶总体积100 mL，添加15%金耳发酵液，7%蔗糖，10%发酵剂（一代酸奶），于42℃按时间发酵3、4、5、6、7 h，依次取出，转入 4 ℃冰箱后熟 18 h，对成品进行感官品评以及酸度测定，确定最佳发酵时间[12]。

1.3.4 正交试验

通过分析金耳发酵液添加量、蔗糖添加量、发酵剂接种量、发酵时间4个单因素试验的结果，确定正交水平。采用L9（34）正交试验进行优化，确定金耳发酵液酸奶的最佳发酵工艺见表1[13]。

表1 金耳发酵液酸奶正交水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.4 品质分析

1.4.1 感官评定

样品由20位有感官品评经验的专业技术人员组成鉴评小组进行评定，采用100分制，从乳清析出状态、组织状态、气味滋味、口感4个方面对成品进行综合评价。在自然光下观察乳清析出状态和组织状态，开盖闻气味，用温水漱口，品尝。分别打分，取平均分作为最后分值。金耳发酵液酸奶评分如表2。试验中以纯牛奶制得的原酸奶作为对照。

1.4.2 酸度测定

每组分别取1瓶后熟18 h的酸奶进行酸度测定，参照GB 5009.239-2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》进行酸度滴定[14]。

表2 感官评价标准Table 2 Standard of sensory evaluation for yoghourts

1.4.3 持水力测定

分别取1瓶后熟18 h后的金耳发酵液酸奶成品和普通酸奶的酸奶进行持水力测定，取空离心管称重，记为m1（g），作好试验组标记；分别装入15 g酸奶，称量离心管和酸奶的总质量，记为m2（g）；28℃下，在离心机3 000 r/min离心10 min，将离心管取出，静置10 min后，去除上清液，再称量去除上清液后的重量，记为m3（g）。每组重复测3次，代入持水力计算公式，取其平均值，即得持水力[15]。

1.4.4 乳清析出量测定

将金耳发酵液酸奶成品和普通酸奶在4℃下放置24 h，测定酸奶总高度为H，测定乳清析出层的高度为h，每组重复测3次，代入乳清析出量计算公式，取其平均值，即得乳清析出量[16]。

1.4.5 乳酸菌活菌数测定

分别取后熟18 h后的金耳发酵液酸奶成品和普通酸奶进行乳酸菌活菌数的测定，参照GB 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》进行测定[17]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 金耳发酵液添加量对酸奶风味的影响

金耳发酵液添加量对酸奶品质的影响见图1。

图1 金耳发酵液添加量对酸奶品质的影响Fig.1 Influence of liquid fermentation of Tremella aurantialba additive on yogurt fermentation

酸奶中的酸度主要来源于乳酸菌将乳中的乳糖发酵分解成的乳酸。乳酸可降低胃的pH值，促进乳蛋白质的消化吸收，抑制肠道内有害菌的生长，有益人体的健康。另外，酸奶的酸度能增进产品的风味，增加人们的食欲。酸奶的最佳酸度在70°T～90°T之间，消费者可根据个人的不同口味选择不同酸度的酸奶。

金耳菌丝发酵液添加量不同会对酸奶的感官和酸度造成一定的影响，由图1可以看出，感官评分随着金耳发酵液添加量的增加出现先升高又降低的情况，当金耳发酵液添加量为20%时，乳酸菌以酸奶和金耳发酵液的混合物为发酵培养基进行发酵，条件最为适宜，因此此时的酸奶感官得分最高，酸度也较高，酸奶的颜色均匀一致，无分层，持有浓郁的酸奶香气和柔和的金耳清香风味。当发酵液添加量超过30%时，酸奶和发酵液的比例不适宜，金耳发酵液的味道太浓烈，掩盖了酸奶的风味，口感粗糙，评分较低。

2.1.2 蔗糖添加量对酸奶风味的影响

蔗糖添加量对酸奶品质的影响见图2。

图2 蔗糖添加量对酸奶品质的影响Fig.2 Influence of sucrose additive on yogurt fermentation

由图2可以看出，蔗糖添加量为5%时，酸奶的甜味不足且产酸量过低，使得酸奶味道寡淡；当蔗糖添加量达10%时，酸奶偏甜，导致口感不佳，甜味掩盖了酸奶的风味和金耳发酵液的清香味；而当添加量为7%时，乳酸菌发酵可利用的碳源量适宜，所得的酸奶酸甜适口，得分最高。蔗糖添加量对酸度影响不明显。

2.1.3 发酵剂接种量对酸奶风味的影响

发酵剂接种量对酸奶风味的影响见图3。

图3 接种量对酸奶品质的影响Fig.3 Influence of inoculation amount on yogurt fermentation

由图3可以看出，酸奶的酸度随着接种量的增加而不断升高，当接种量为10%时，经发酵得到的酸奶酸甜适口，口感最佳；接种量超过10%时，乳酸菌数过多，使得糖类过度转化为乳酸，使得酸奶过酸不适口，口感差，接种量少于10%时，产酸量过低所以出现酸奶凝固性不好，组织状态不佳，因此，选择接种量为10%。酸度随接种量的增加而增加，但考虑到口感，仍以接种量为10%为最佳接种量。

2.1.4 发酵时间对酸奶风味的影响

发酵时间对酸奶风味的影响见图4。

图4 发酵时间对酸奶品质的影响Fig.4 Influence of fermentation time on yogurt fermentation

由图4可以看出，酸奶的酸度随着发酵时间的延长而逐渐升高，当发酵时间到达5 h时，酸奶完全凝固，酸甜适口，既有金耳的清香味又有酸奶的风味；当发酵时间少于5 h时，酸奶没有完全凝固，酸味较淡，品质相对较差，说明发酵时间不足没有足够的乳酸产生；当发酵时间超过5 h时，酸奶发酵时间过长，产酸过多，口味偏酸，且有一些其他次级代谢产物产生使酸奶味道有点苦涩，质量较差。

2.2 正交试验

正交试验结果分析见表3。

表3 正交试验结果分析Table 3Results of orthogonal experiment L9（34）

由表3可知，对金耳发酵液酸奶品质的影响中主次因素排序为B＞C＞A＞D，由此可得出，蔗糖添加量是影响金耳发酵液酸奶品质的重要因素，其次是接种量、金耳发酵液添加量、发酵时间；由极差分析可以得出金耳发酵液酸奶的最佳组合是A1B2C3D1，为验证正交试验结果，将培养条件为A1B2C3D1重新设定试验，试验设置3个重复，经过验证试验结果可知此条件下感官评分94，与正交试验结果较为一致。因而金耳发酵液酸奶的最佳工艺条件为金耳发酵液添加量15%，蔗糖添加量7%，接种量13%，发酵时间4 h，获得的酸奶品质最佳。

2.3 金耳发酵液酸奶与普通发酵酸奶品质分析比较

按照正交试验确定的最佳金耳发酵液酸奶配方进行加工制作酸奶，以正交试验确定的最佳工艺条件制作普通发酵酸奶（空白对照组不加金耳发酵液），后熟后通过对成品进行感官评分以及持水力、酸度、乳清析出量、乳酸菌活菌数的测定，比较金耳发酵液酸奶与普通发酵酸奶的品质。结果如表4所示。

通过乳清析出状态、组织状态、气味滋味、口感4个方面对成品进行感官综合评定。由表4可以看出，金耳发酵液酸奶的感官评分为93.4分，普通发酵酸奶为82.6分，说明金耳发酵液的加入可以改善酸奶感官品质。持水力是影响组织状态的一个重要指标，金耳发酵液酸奶的持水性为90.72%，比普通发酵酸奶的持水性高出5.05%，这主要是因为金耳菌丝发酵液中含有大量的金耳多糖，菌体细胞通过丝状的多糖与周围的蛋白质凝块相连形成复杂而稳定的网络结构。这种网络结构的形成有利于改善发酵乳的流变特性，减少酸奶乳清析出[18]。金耳发酵液酸奶的滴定酸度为89.4°T，普通发酵酸奶的酸度为78.1°T，两种酸奶的酸度接近但含有金耳发酵液的酸奶酸度仍略高于普通酸奶，主要是因为金耳发酵液中含有一些可以促进乳酸菌生长繁殖的成分，使得乳酸转化率较高。根据发酵乳的食品安全国家标准规定，发酵乳的酸度值≥70°T，金耳发酵液酸奶酸度和普通酸奶的酸度都达到国标发酵乳酸度值的要求。从表4中看出两种酸奶乳清析出量差别不大，没有达到显著差异。金耳发酵液酸奶中的乳酸菌活菌数量显著高于普通发酵酸奶的乳酸菌活菌数量，这可能是由于金耳发酵液中不仅含有多糖，还可能肽类、核苷酸、氨基酸等小分子化合物，这些成分是酸奶发酵剂菌种的促生长因子，都有利于促进乳酸菌的生长繁殖，因此使得金耳发酵液酸奶中活菌数高于普通酸奶[8]。

表4 金耳发酵液酸奶与普通酸奶品质分析对比Table 4 Quality Analysis between control yoghurt and Liquid Fermentation of Tremella aurantialba Yoghurt

3 结论

本文单因素试验及四因素三水平正交法试验，预测金耳发酵液酸奶的最佳配方条件并进行验证。得出金耳发酵液酸奶的最佳工艺条件为：金耳发酵液添加量为15%，蔗糖添加量为7%，乳酸菌接种量为13%，发酵时间为4 h，在此工艺参数下发酵的金耳发酵液酸奶品质最佳。金耳发酵液能够提高酸奶的持水能力和降低乳清的析出量，改善酸奶的质地，使酸奶口感更加细腻，从而提高酸奶的品质。对所得的酸奶进行指标测定，乳酸菌活菌数达到6.50×108CFU/mL。

金耳发酵液酸奶集酸奶与金耳的营养于一体，具良好的保健价值，酸甜适口，易为大众接受。该产品的开发既会弥补市售酸奶的品种不足，又会为人参果的深加工利用开辟一条新路，相信将有有广阔的开发前景。