宣木瓜抑菌特性及其饮料的活性成分研究

商亚芳，苗俊豪，张一格，曹衡，蔡华珍，贾小丽，步显勇，谢艳，魏兆军，*

（1.滁州学院滁州学院博士后工作站，安徽滁州239000；2.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥230009；3.滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州239000；4.安徽盼盼食品有限公司，安徽滁州239000）

宣木瓜为蔷薇科木瓜属植物贴梗海棠[Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai]果实，习称“皱皮木瓜”，是安徽省宣城市的道地药材，是我国特有的药食两用保健型水果。中医认为木瓜有舒筋、活络、健脾开胃、舒肝止痛、祛风除湿之功效[1]。已有研究表明，宣木瓜中含有糖类、齐墩果酸、熊果酸、有机酸、黄酮类等物质，具有保肝、抗炎镇痛、祛风除湿、抗肿瘤、增强免疫力等功效[2-14]。利用水和乙醇溶液提取获得的宣木瓜粗提物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌等有害菌具有抑制作用，但抑菌活性成分的分布尚未明确[15]。本研究以宣木瓜为研究对象，利用平板打孔法逐步筛选抑菌活性成分，明确具有抑菌活性的成分在宣木瓜粗提物中的分布。宣木瓜由于口感酸涩，不能直接作为新鲜水果食用，果脯由于含有较高糖分能够掩盖其酸涩口感，成为宣木瓜果实的重要加工产品。当地居民通过水浸泡宣木瓜的方法降低其酸涩口感，制作宣木瓜即食饮料食用新鲜的宣木瓜果实，宣木瓜果实经水长时间浸泡后会损失大量的水溶性活性成分，降低宣木瓜的食用价值。本研究利用乳酸菌发酵宣木瓜，进行宣木瓜饮料的开发，该产品保留了宣木瓜的所有有效成分，利用宣木瓜中含有大量有机酸及抑菌活性成分的特性，不添加任何防腐剂和色素等食品添加剂，口感微酸，风味宜人，具有一定的营养保健价值。本研究重点考察了宣木瓜饮料在冷藏过程中，内部活性成分包括多糖、三萜、黄酮、多酚类化合物及抗氧化活性的变化，为研究宣木瓜饮料成品在冷藏过程中的稳定性奠定了一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宣木瓜：宣城市宣海棠食品有限公司；乳酸菌：北京日创电器；大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylocaccus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）由合肥工业大学微生物实验室提供；槲皮素、熊果酸、维生素C、儿茶素等（均为色谱纯）：国家标准品检定研究所；乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿均为分析纯，培养基原辅料均为化学纯：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SPX-150B-Z型MODEL生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；JYZ-V907九阳榨汁机：九阳股份有限公司；TDL-40B离心机：上海安亭科学仪器厂；DFT-100多功能中药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-300 VDE型双频数控超声波清洗机：昆山市超声仪器公司；SPX－150B－Z型MODEL生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LDZX－40型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；pH计：梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；E－poch2酶标仪：美国伯腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取宣木瓜提取物

将宣木瓜干制品烘干至水分小于5%后粉碎，过40目筛，密封备用。称取10 g宣木瓜粉，按料液比1 ∶15（g/mL）加入 70%乙醇 150 mL，进行回流提取，提取时间为3 h获得提取液，经离心后，取上清液进行旋转蒸发，获得宣木瓜提取物固态浸膏4.0 g。

1.3.2 宣木瓜抑菌试验

将宣木瓜提取物配置成浓度为0.5 g/mL的粗提物原液。牛肉膏蛋白胨培养基的制备：取牛肉膏，氯化钠各1 g，胰蛋白胨2 g，琼脂4 g加入水200 mL，溶解后，放入高压灭菌锅，121℃，灭菌20 min。

1.3.3 菌悬液的制备

将冷冻保存的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在无菌条件下划线接种至平板培养基，在37℃恒温箱培养24 h；转接2次，得到长势良好的菌种，置于0℃～4℃下冷藏备用。分别挑取各菌种经24 h活化培养后的单菌落在无菌条件下接种至已灭菌的含有100 mL液体培养基的三角烧瓶中，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌在37℃、200 r/min摇床培养，酵母菌和黑曲霉菌在28℃、200 r/min摇床培养，采用平板计数法使其菌悬液浓度大约为106CFU/mL～107CFU/mL，存放于4℃的冰箱中保存[16]。

1.3.4 牛津杯抑菌试验

参照文献方法[17-18]，稍作改动，每组做3个平行，放置于37℃培养箱静置培养，以蒸馏水代替宣木瓜提取物作为阳性对照。利用游标卡尺，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，以直径表示抑菌圈的大小。

1.3.5 宣木瓜抑菌活性成分分离

将宣木瓜提取物用蒸馏水充分溶解后，利用有机溶剂进行分层萃取，分别获得乙酸乙酯层、正丁醇层、三氯甲烷层和水层。各萃取层经旋转蒸发后，经蒸馏水溶解分别进行抑菌试验，各萃取层的抑菌浓度均为0.5 g/mL。

1.3.6 宣木瓜饮料制备工艺流程

原料→选择→清洗→去籽，切片→发酵→榨汁→离心过滤→混合→稀释→灌装→杀菌→冷却→检验→成品

1.3.7 操作要点

1.3.7.1 发酵

选取果皮青色的新鲜宣木瓜，将新鲜的宣木瓜清洗切片，按10 g∶1 g取新鲜的宣木瓜和乳酸菌，乳酸菌为保加利亚乳酸菌和嗜热链球菌按质量比1∶1混合的混合菌。加入蒸馏水，新鲜宣木瓜：蒸馏水为1 g∶10 g。在温度30℃～45℃培养24 h～36 h，得到新鲜宣木瓜的浸泡发酵液和浸泡发酵祛涩的宣木瓜。

1.3.7.2 调配

将新鲜宣木瓜的浸泡发酵液经过滤，得发酵清液备用。将浸泡发酵祛涩的宣木瓜上清液在高速离心机以 3 000 r/min，离心 3 min，使用 0.45 μm 滤膜过滤，得上清液。按体积比2 mL∶3 mL将发酵清液和上清液混合，得到高浓度混合果汁，按体积比1 mL∶2 mL在高浓度混合果汁中加入蒸馏水进行稀释，得到口感适宜的宣木瓜功能饮品。调配优化方法参考相关专利[19]：一种抗氧化宣木瓜功能饮品（申请号：201710863172.5）

1.3.7.3 均质杀菌

将调配好的复配饮品进行均质，均质前进行预热，达到60℃～65℃，均质压力为10 MPa～20 MPa。将得到的宣木瓜低涩饮料在杀菌锅中110℃杀菌30 min。

1.4 宣木瓜饮料指标测定

为了进一步明确宣木瓜低涩饮料内有效活性成分的稳定性，试验设置冷藏的3个不同阶段[新鲜饮料（A），冷藏 40 d后（B），冷藏 90 d后（C）]，对饮料内部的有效成分（多糖、三萜、黄酮、多酚、抗氧化活性）进行测定。理化指标：采用pH计测定酸度。微生物指标：按GB 4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》、GB4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》、GB4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》规定的方法检验，检验单位为CFU/mL。

1.4.1 多糖的测定

用苯酚-硫酸方法测定宣木瓜提取物中的多糖含量。称取于105℃烘干至恒重的葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶定容，配成浓度为0.04 mg/mL葡萄糖母液。取0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2.0 mL 于试管中加蒸馏水至2.0 mL，加入1 mL 6%苯酚，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，静置5 min，沸水浴中加热30 min，迅速冷却至室温25℃，于490 nm处测吸光值，绘制标准曲线。取0.05 mL饮料于试管中加蒸馏水至2 mL，加入1 mL 6%苯酚，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，静置5 min，沸水浴中加热30 min，迅速冷却至室温25℃，于490 nm处测吸光值，检测宣木瓜中多糖含量，并以葡萄糖当量进行表示[mg葡萄糖当量（G）/mL饮料]。

1.4.2 三萜的测定

采用香草醛-冰醋酸方法测定宣木瓜提取物中的三萜类化合物含量。精确称取于80℃烘干至恒重的熊果酸4.6 mg于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容。取0.0、0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 mL 标准熊果酸溶液，于 80 ℃水浴锅中挥发乙酸乙酯。加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，72%硫酸5 mL，于65℃恒温水浴锅中加热20 min后，于冰水中静置5 min。样品于532 nm处测定吸光值，绘制标准曲线。取宣木瓜饮料1 mL，于80℃水浴锅中挥发溶液，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，72%硫酸5 mL，于65℃恒温水浴锅中加热20 min后，于冰水中静置5 min。样品于532 nm处测定吸光值。检测宣木瓜中三萜含量，并以熊果酸含量的方式进行表示，（mg熊果酸当量（U）/mL饮料）。

1.4.3 总酚的测定

利用福林酚法采用儿茶素作为标准品测定饮料中的总酚含量，试验方法参考文献[20]。取稀释相应倍数的样品10μL样品置于96平板中，并依次加入70 μL水和20 μL福林酚试剂（2N）置于暗处反应5 min，加入20%碳酸钠100 μL后置于暗处反应30 min。利用酶标仪测定混合物在730 nm处的吸光值。儿茶素作为标准品用来测定提取液中的总酚含量。最终结果表示为每毫升饮料中含有儿茶素（E）当量（mg）的总酚。

1.4.4 黄酮的测定

利用AlCl3·6H2O法测定饮料中的黄酮含量[21]。取20 μL 饮料，加入 90 μL 乙醇后加入 100 μL 2%AlCl3·6H2O，置于暗处反应5 min，于430 nm测定读数。利用槲皮素作为标准品，制定标准曲线。饮料中的黄酮含量以槲皮素当量表示mg槲皮素（Q）/mL饮料。

1.4.5 抗氧化性的测定

采用测定饮料的抗氧化活性，试验方法参考文献[21]。采用ABTS法（取宣木瓜提取物液稀释5倍后，经0.45 μm滤膜过滤，准确称取33 mg ABTS和28.4 mg过硫酸钾于100 mL水中充分溶解，置于暗处16 h后使用。取不同体积（10 μL～50 μL）的宣木瓜提取液稀释至100 μL，与100 μL ABTS置于暗处混合5 min后，用酶标仪于734 nm处读数，计算宣木瓜提取液清除ABTS自由基的IC50，以维生素C为标准品，并测定其IC50）当自由基清除率为50%时，每100 mL宣木瓜饮料中含有抗氧化活性物质的维生素C当量（mg VC/100 mL饮料）。

利用经过修改的DPPH分析方法分析饮料的抗氧化活性，并以VC作为标准品。利用乙醇作为溶剂准备标准品VC储备液（1 mg/mL）。利用乙醇稀释DPPH试剂准备DPPH工作液（0.15 mg/mL）。在分析之前，饮料用乙醇稀释2倍，取5 μL提取物加于96平板中，加入95 μL乙醇后加入100 μL DPPH溶液，将上样后的96平板在温室25℃条件下置于黑暗处静置30 min，所有样品均以乙醇作为空白，利用酶标仪与波长515 nm处读取各样品的吸收波长，所有样品以乙醇作为参考对照。结果表示为：当对DPPH自由基清除能力为50%时，每100 mL饮料中含有的抗氧化物质含量的VC当量（mg VC/100 mL饮料）。

2 结果与分析

2.1 宣木瓜抑菌活性

当宣木瓜粗提物浓度为0.5 g/mL时，对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的抑菌圈大小分别为18、22、20 mm，抑菌效果较好。为进一步明确宣木瓜抑菌活性成分的分布，粗提物的水溶液分别经正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取物进行旋转蒸发干燥后，测定抑菌活性见表1。

由表1可知，各层均有抑菌活性，且乙酸乙酯层抑菌效果最佳，试验结果表明宣木瓜粗提物中具有抑菌活性的有效成分较多，且处于不同极性范围。宣木瓜中的熊果酸和齐墩果酸均具有较强的抑菌活性，且经有机溶剂萃取后，熊果酸和齐墩果酸主要富集在乙酸乙酯层，本试验中乙酸乙酯层具有最强的抑菌活性，可能与熊果酸和齐墩果酸有关[22-23]。然而，各萃取层的具体抑菌活性成分需进一步验证。

表1 宣木瓜提取物各萃取层的抑菌活性Table 1 Antibacterial activities of different extract layers of Xuan Mugua

2.2 产品质量与卫生标准

本饮料采用专利：一种抗氧化宣木瓜功能饮品（申请号：201710863172.5）中的优化方法获得，饮料成品呈现乳白色，口感微酸，具有淡淡的清香，经乳酸菌发酵后的宣木瓜中单宁含量降低了78%，有效降低了饮料成品的涩感[24]。饮料的酸度随着保藏时间的延长出现先下降后上升的趋势，90 d后pH值由3.3升至3.2，口感变化不大。每升饮料中含有的多酚类化合物相当于儿茶素1.08 g，利用ABTS/DPPH方法测定宣木瓜饮料的抗氧化活性，当自由基清除率为50%时，每升饮料中含有的抗氧化物质分别相当于VC0.57 g和0.34 g[19]。饮料中大肠菌群、菌落总数＜1 CFU/mL，致病菌未检出，符合卫生标准。

2.3 宣木瓜饮料在冷藏过程中各指标的测定

宣木瓜果实中含有丰富的多糖，三萜及酚类化合物，为了明确宣木瓜饮料在保藏过程中内部活性成分的变化，本试验检测了在不同保存期内饮料内部活性成分的变化见表2。

由表2可知，饮料中的多糖含量在90 d内的冷藏期内由初始的0.735 mg葡萄糖/mL降低至0.703 mg葡萄糖/mL饮料，三萜类化合物的含量呈现先上升（由0.245 mg熊果酸/mL上升至0.401 mg熊果酸/mL饮料）后下降（0.322 mg熊果酸/mL饮料）的趋势，总酚类化合物则在保藏期间持续下降（由1.269 mg儿茶素/mL降至1.101 mg儿茶素/mL饮料），黄酮类化合物出现先下降后上升的趋势。饮料内部活性成分发生波动性变化，可能是由于饮料在冷藏过程中酸度的变化导致多糖、三萜、多酚和黄酮类化合物的溶解性发生变化。利用ABTS和DPPH测定饮料的抗氧化活性，则发现DPPH方法测得的活性逐渐减小（由10.47 mg VC/100 mL饮料降至6.30 mg VC/100 mL），而ABTS方法则是先下降后上升的趋势（由7.55 mg VC/100 mL上升至10.09 mg VC/100 mL），ABTS抗氧化活性增强，可能与饮料中三萜，总酚及黄酮总含量的升高有关。两种方法出现的结果不同，可能是由于二者使用的溶剂载体不同，ABTS方法内主要是水溶性化合物的抗氧化活性，而DPPH方法则是醇溶性化合物起主要作用。

表2 宣木瓜饮料内部活性成分在冷藏期间的变化Table 2 Change of active ingredients in the beverage during refrigeration

3 结论

宣木瓜作为安徽省宣城市药食同源的道地药材，具有较高的营养价值、经济价值和开发前景。本研究发现宣木瓜提取物具有较好的抑菌效果，以宣木瓜为原料，经过发酵，调配，灭菌等一系列工艺制作的饮料在保藏期间的内部活性成分三萜和黄酮含量在冷藏90 d后，含量分别上升了31%和2%，多糖和总酚含量则出现下降，分别下降了5%和14%。酸度变化不大。虽然饮料在储藏过程中抗氧化活性程度出现波动，但总体仍保持较好的抗氧化活性。本研究为提升宣木瓜精深加工技术水平和综合开发利用价值奠定了重要基础。